現 † 現地址：英國 OX110DE , 英國牛津郡迪特科特哈威爾科學創新園鑽石大廈，鑽石光源有限公司，電子生物成像中心。
反應中心光收穫複合物1（ RC-LH1）係紫色光補細菌嘅核心光合作用成分。我哋介紹咗兩個來自黑假單胞菌嘅 RC-LH1複合體嘅冷凍電子顯微鏡結構。 RC-LH114-W 複合物嘅2.65-Å 分辨率結構由14個亞基 LH1環包圍住 RC 組成，而呢個環係由蛋白質 W 打斷，而冇蛋白質 -W 嘅複合物係完全由 RC 包圍嘅 RC 組成。閉合咗16個亞基 LH1循環。呢啲結構嘅比較可以提供對 RC-LH1複合體中醌嘅動力學嘅見解，包括喺 RC QB 位點結合醌嗰陣之前未確定嘅構象變化，同埋輔助醌結合位點嘅位置，呢啲位置有助於將佢哋傳遞到 RC 。 W 蛋白嘅獨特結構阻止咗 LH1環嘅閉合，從而創造咗一個加速醌/喹諾酮交換嘅通道。
光合作用所提供嘅能量幾乎可以維持地球上所有嘅生命，而且佢對太陽能生物技術有好大嘅潛力。喺促進全球光合作用嘅同時，紫色光補細菌亦都展現出唔同嘅能量模式同代謝能力。佢哋可以避免光合作用，喺黑暗中生長成異補細菌，可以固定氮同二氧化碳，產生氫氣，同埋降解芳香族化合物（1-3）。為咗為呢啲過程提供能量，光必須快速有效噉轉化為化學能量。當光捕捉天線複合體吸收光，並將被困住嘅能量轉移到反應中心（ RC ），從而開始電荷分離嗰陣，呢個過程就會開始（4 – 7）。紫色光補細菌嘅光合作用嘅基本單位係由2型 RC 組成，周圍有光收穫複合物1（ LH1），形成 RC-LH1核心複合物。 LH1係由一組彎曲嘅 αβ 異二聚體形成，每個異二聚體都會結合兩個細菌葉綠素（ BChl ） a 分子同一個或兩個胡蘿蔔素（8-12）。最簡單嘅 LH1天線由16或17個 α β 異二聚體組成，喺一個閉環中包圍 RC （9-13），但係喺其他核心複合體中，跨膜肽會打斷周圍 LH1嘅連續性，從而促進 RC 同細胞色素 bc13複合體之間嘅喹諾/醌擴散（115）。紫色光補植物紅假單核菌（ Rps . ）係一種可以理解支援光合作用嘅能量同電子轉移嘅模型生物。第一個晶體結構係 Rps 。 palustris RC-LH1複合體嘅模型係 RC ，周圍有15個異二聚體 LH1環，而呢啲環會被一種叫做「蛋白質 W 」嘅未知蛋白質打斷（14）。隨後，蛋白質 W 被鑑定為 RPA4402，呢個係一種未表徵嘅10.5kDa 蛋白質，有三個預測嘅跨膜螺旋（ TMH ）（16）。我哋提議將編碼蛋白質 W 嘅 rpa4402基因改名做 pufW ，以便同編碼 RC-L 、 M （ pufL 、 pufM ）同 LH1 α 、 β （ pufA 、 pufB ）亞基嘅基因所用嘅命名方式一致。有趣嘅係，蛋白質 -W 只係存在於大約10 % 嘅 RC-LH1，顯示出 Rps 。帕魯斯特會產生兩種唔同嘅 RC-LH1複合物。喺呢度，我哋報告咗兩個核心複合物嘅高分辨率冷凍電磁（ cryo-EM ）結構，一個有蛋白質 W 同14個 α β 異二聚體，另一個冇蛋白質 W 同埋一個閉合嘅16個異二聚體 LH1環。我哋嘅結構代表咗對 Rps 嘅 RC-LH1複合物嘅理解有一個步驟性嘅變化。 palustris , 因為我哋分析咗每個变體嘅均質群體，並且有足夠嘅分辨率，可以清楚分配每個肽同結合色素同相關嘅脂質同醌。呢啲結構嘅比較顯示，到目前為止喺任何其他 RC-LH1複合物中都未發現嘅三種 TMH 蛋白 -W 會產生一個醌通道，以加速醌/喹諾酮交換。已經鑑定咗好多保守嘅脂質同醌結合位點，而我哋喺醌同 RC 組合之後，發現咗一個新嘅構象變化，呢個變化可能適合氧化光補生物嘅光系統 II （ PSII ） RC 。我哋嘅研究結果為紫色光補細菌嘅 RC-LH1核心複合物中醌/喹諾酮結合同交換嘅動力學提供咗新嘅見解。
為咗方便詳細研究 Rps 中發現嘅兩種複合物。我哋用生化方法分離每個 RC-LH1。蛋白質 W 缺乏複合物（以下簡稱 Δ pufW ）係由缺乏 pufW 基因嘅菌株純化出嚟（16），而且只可以產生一個 RC-LH1複合物。含蛋白質 W 嘅複合物係由一種菌株產生。呢個菌株嘅蛋白質 W 係用10x His 標籤喺佢嘅 C 末端修飾，令到含有蛋白質 W 嘅複合物可以透過固定金屬同大部分缺乏嘅蛋白質 W 有效結合。複合物係有效分離嘅（16）親和色譜（ IMAC ）。
如圖1所示，兩個複合物都含有一個由 LH1天線包圍嘅三個亞基 RC （ RC-L 、 RC-M 同 RC-H ）。缺乏蛋白質 -W 嘅複合物嘅2.80-A 結構顯示出16個 α β 異二聚體，形成一個完全包圍住 RC 嘅閉合 LH1環，以下簡稱 RC-LH116複合物。含蛋白質 W 嘅複合物嘅 2.65Å 結構有一個由蛋白質 W 中斷嘅14杂二聚體 LH1，以下簡稱 RC-LH114-W 。
（ A 同 B ）化合物嘅表面表示。 （ C 同啲）以棒狀表達嘅結合顏料。 （ E 同 F ）喺細胞質表面觀察到嘅複合物有卡通片所示嘅肽同 LH1亞基，並且由蛋白質 -W 間隙順時針編號［同 Rba 編號一致。球形复合物（13）］。對於 LH1- α ，蛋白質亞基嘅顏色係黃色；對於 LH1- β ，蛋白質亞基嘅顏色係藍色；對於蛋白質 -W ，蛋白質係紅色；對於 RC-H 嚟講，佢係青色嘅；對於 RC-L 嚟講，佢係橙色；對於 RC-M ，洋紅色。輔因子用棒表示，綠色代表 BChl 同 BPh a 分子，紫色代表胡蘿蔔素，黃色代表 UQ10分子。 （ G 同 H ） RC-LH114-W 複合物（ G ）同 RC-LH116複合物（ H ）嘅等效區域蛋白質 -W 間隙嘅放大圖。輔因子係以空間填充嘅形式顯示，螯合醌係以藍色顯示。蛋白質 -W 間隙喺（ G ）入面用藍色虛線突顯，而喺 LH116環上面擴散嘅醌/喹諾醇嘅小孔用黑色虛線喺（ H ）入面突顯。
圖1（ A 同 B ）顯示咗由開放或閉合嘅 LH1αβ 異二聚體陣列包圍嘅 RC ，每個異二聚體都會結合兩個 BChl 同一個胡蘿蔔素（圖1、 C 同啲）。以往嘅研究顯示 Rps 係 LH1複合體。喺螺旋藻黃素嘅生物合成途徑中，呢啲物種含有胡蘿蔔素嘅混合群體（17）。但係，螺吡咯黃素係主要嘅類胡蘿蔔素，而且佢嘅密度令人滿意。所以，我哋選擇喺所有 LH1結合位置建模螺旋黃素。 α 同 β 多肽係單一 TMH ，有短嘅膜外區域（圖1、 A 、 B 、 E 同 F ）。雖然冇觀察到 C 末端嘅17個殘基嘅密度，但係兩個複合物中嘅 α 多肽都由 Met1切割到 Ala46。 β 多肽喺 RC-LH116中由 Gly4還原到 ​​Tyr52，而喺 RC-LH114-W 中由 Ser5還原到 Tyr52。冇觀察到3個或4個 N 末端或13個 C 末端殘基嘅密度（圖 S1）。由野生型菌株製備嘅混合 RC-LH1複合物嘅質譜分析顯示，缺失嘅區域係呢啲肽嘅異源裂解嘅結果（圖 S1同 S2）。亦都觀察到 α-Met1嘅 N 末端甲酰化（ f ）。分析顯示， α - 肽由殘基 fMet1至 Asp42/Ala46/Ala47/Ala50組成，而 β - 肽由殘基 Ser2至 Ala53組成，同低溫 EM 密度圖非常吻合。
α-His29同 β-His36嘅協調令 BChls 面對面；每個 α β 異二聚體都會同佢嘅鄰居組裝，形成一個開環（ RC-LH114-W ）或者一個閉環（ RC-LH116），圍繞住 RC 激子耦合顏料陣列（圖1、 C 同啲）。同 RC-LH114-W 嘅877納米波段相比， RC-LH116嘅880納米吸收紅移係3納米（圖2A ）。然而，圓形二色性光譜幾乎相同（圖2B ），表明雖然開環同閉環之間有明顯嘅差異，但係 BChls 嘅局部環境係非常相似。吸收紅移可能係閉環上熱運動減少同穩定性增加嘅結果（18，19）、閉環引起嘅顏料耦合變化（20、21），或者係呢兩個效應嘅組合（11）。
(A) 紫外線/可見光/近紅外線吸收光譜，其峰用佢哋相應嘅顏料標記，並標準化為775 nm 嘅 BPh 峰。 (B) 圓形二色性光譜標準化為805 nm 嘅 BChl 吸光度。 （ C 同啲）喺 RC-LH114-W 複合物（ C ）同 RC-LH116複合物（啲）嘅時間分辨吸收光譜中選擇嘅 ΔA 光譜。為咗更好嘅可比性，所有光譜都會喺0.2 ps 嘅情況下標準化為 −A 嘅 ∆A 。 (E) 喺唔同濃度嘅 UQ2存在下，照射後細胞色素 c2氧化嘅速率（原始數據請睇圖 S8）。 （ F ）喺低、中或高強度光（分別係10、30或300μMm-2 s-1）下生長嘅細胞中，純化複合物中嘅蛋白質 W 同 RC-L 亞基同分離嘅膜比例。透過 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳同免疫測定法測定蛋白質水平（原始數據請睇圖 S9）。決定相對於純化嘅 RC-LH114-W 複合物嘅比例。複合物嘅 RC-L 同蛋白質 -W 嘅化學量比例係1:1。
喺 RC-LH114-W 嘅變形 α β 14環中，位置1嘅 BChl （圖1、 A 、 C 同 E ）比起 RC-LH116嘅等效 BChl 更接近 RC 初級供體（ P ）6.8 Å （圖1、 B 、啲同 F ，同埋圖 S3）；然而，兩種錯聚物嘅瞬態吸收動力學顯示，對於 RC-LH114-W 同 RC-LH116，由 LH1到 RC 嘅激發能量轉移時間常數係40 ± 4同44 ± 3 ps （圖2）。 ， C 同啲，圖 S4同表 S2）。 RC 內部嘅電子轉移亦都冇顯著差異（圖 S5同相關嘅補充文字）。我哋懷疑 LH1同 RC-P 之間嘅能量轉移時間嘅密切對應係因為兩個 LH1環中大部分 BChl 嘅距離、角度同潛能相似。似乎探索 LH1能量模式去達到最小距離並唔係快過由次優位置直接將能量轉移到 RC 。 RC-LH114-W 中嘅開環 LH1環亦可能喺低溫條件下經歷微不足道嘅熱運動，以便進行結構分析，而且喺室溫下，由 RC 1位置嘅 βBChls 嘅色素沉澱距離，有較長嘅 α β 14環架構。
RC-LH116複合物含有32個 BChls 同16個胡蘿蔔素，而佢嘅整體排列同由熱染色體（ Tch . ） pidpidum [ 蛋白質數據庫（ PDB ） ID 5Y5S］（9）、硫代弧菌（Trv .）970菌株（ PDB ） alga ID172C9所得嘅相同（ Blc . 維里迪斯）（ PDB ID 6ET5）（10）。對齊後，只觀察到 α β 異二聚體位置有小偏差，特別係1-5、15同16（圖 S6）。蛋白質 -W 嘅存在對 LH1嘅結構有顯著影響。佢三個 TMH 係由短環連接， N 末端喺複合體嘅腔側，而 C 末端喺細胞質側（圖1A 同3， A 至啲）。蛋白質 -W 係大部分疏水性嘅（圖3B ），而 TMH2同 TMH3同 LH1αβ-14相互作用，形成跨膜表面（圖3、 B 同 E 至 G ）。界面主要係由跨膜區域嘅 Phe 、 Leu 同 Val 殘基組成。呢啲殘基係由疏水氨基酸同 αβ-14顏料堆疊而成。有啲極性殘基亦都有助於相互作用，包括複合腔表面嘅 W-Thr68同 β-Trp42之間嘅氫鏈（圖3、 F 同 G ）。喺細胞質表面， Gln34同 α β -14類胡蘿蔔素嘅酮基相鄰。另外，正十二烷基 β -d- 麥芽糖苷（ β -DDM ）分子被分解，而佢嘅疏水尾延伸到蛋白質 -W 同 α β -14之間嘅界面，而脂質尾可能位於體內。我哋亦都留意到蛋白質 W 同 RCH 嘅 C 末端解析區域非常接近，但係唔喺形成特定相互作用嘅範圍之內（圖1、 A 同 E ）。然而，呢兩種蛋白質嘅未解決嘅 C 末端氨基酸可能存在相互作用，呢個可能會提供一個機制，喺 RC-LH114-W 複合體嘅組裝過程中招募蛋白質 -W 。
（ A ）蛋白質 -W 以卡通形式面向同 LH1αβ14嘅界面，有一條棒形嘅側鏈（紅色），顯示喺靜電電位圖嘅一部分（透明灰色表面，等高線水平係0.13）。 (B) 由疏水彩色表面所代表嘅蛋白質 -W 。極性同帶電區域用青色顯示，疏水區域用白色顯示，強烈疏水區域用橙色顯示。 （ C 同啲）以卡通形式表示嘅蛋白質 -W ，佢嘅方向同（ A ）（ C ）一樣，並且旋轉180 °（啲）。根據序列中嘅位置，可分辨嘅殘基採用彩虹配色方案，其中 N 末端係藍色，而 C 末端係紅色。 （ E ）同（ A ）相同嘅視圖中嘅蛋白質 -W ，而蛋白質 -W ： LH1界面嘅殘基係用帶有附加標記嘅棒表示。 （ F ）蛋白質 -W 喺卡通表示中相對於（ E ）同 LH1 α β 14，同埋相對於棒表示中嘅界面殘基，旋轉90 ° 。標記咗嚟自 β 多肽嘅懸垂殘基。輔因子係以一條同圖1嘅顏色相符嘅棒顯示，分解嘅 β-DDM 係用灰色顯示，而氧氣係用紅色顯示。 （ G ）（ F ）入面嘅視圖旋轉180 ° ，有標記咗嘅 α 多肽嘅突出殘基。
蛋白質 -W 取代咗一個 α β 異二聚體（圖1F 中嘅第15個），從而防止環閉合同埋傾斜頭三個 αβ 異二聚體。觀察到第一個 α β -1異二聚體相對膜法線嘅最大傾斜角係25 ° 至29 ° （圖1， A 同 E ），呢個係由 RC A 鮮明對比 -LH116中 αβ-1嘅2 ° 至8 ° 傾斜所形成（圖1， B 同 F ）。第二同第三異二聚體分別傾斜喺12 ° 至22 ° 同5 ° 至10 ° 。由於 RC 嘅空間位阻， α β -1嘅傾斜唔包括第二對 α β （對應圖1F 中嘅第16個 α β ），因此喺 LH1環中形成一個明顯嘅間隙（圖1、 A 同 E ）。由於缺乏兩個 α β 異二聚體，伴隨住四個 BChl 同兩個胡蘿蔔素嘅損失，所以冇一個胡蘿蔔素會同扭曲嘅 α β -1亞基結合，導致一個 LH114-W 環，入面有13個胡蘿蔔素素食同28個 BChls 。 αβ1至7區域嘅兩個複合物嘅局部分辨率估計值低過 LH1環嘅其餘部分，呢個可能反映咗鄰近 RC QB 位點嘅 LH1亞基嘅固有可塑性（圖4）。
RC-LH114-W （ A 同 B ）同 RC-LH116（ C 同啲）嘅圖片係由圖1嘅相同頂視/側視圖（ A 同 B ）（ A 同 C ）同空腔表面顯示。（ B 同啲）。彩色嘅鍵喺右邊顯示。
唯一另一個化學量比為1:14嘅特徵核心複合物係球形紅球菌（ Rba . ） RC-LH1-PufX 二聚體（13）。但係，蛋白質 W 同 PufX 冇明顯嘅同源性，而且對佢哋各自嘅 LH1結構有顯著影響。 PufX 係一個單一嘅 TMH ，佢有個 N 末端細胞質結構域，喺對應 Rps 嘅位置同 RC-H 亞基（13）嘅細胞質側相互作用。 LH116αβ-16。 PufX 會為 RC-LH1同細胞色素 bcl 複合物之間嘅醌/喹諾酮交換創造一個通道，並且存在於所有 Rba 中。球形核心複合體（13）。雖然單體 - 單體界面係喺 Rba 入面。球狀體 RC-LH1-PufX 二聚體位於 RC-LH114-W 中蛋白質 W 嘅結合位置，而 PufX 同蛋白質 -W 誘導嘅間隙喺等效位置（圖 S7A ）。 RC-LH114-W 嘅缺口亦都同玫瑰假單核菌 LH1嘅假設醌通道（8）一致，呢個通道係由同蛋白質 W 或 PufX 無關嘅肽所形成（圖 S7B ）。另外， Blc 入面嘅醌通道。由排除一個 γ 亞基（7）所形成嘅翠綠色 LH1位於類似嘅位置（圖 S7C ）。雖然係由唔同嘅蛋白質介導，但係呢啲醌/喹諾醇通道喺 RC-LH1複合體嘅共同位置嘅出現似乎係收斂進化嘅一個例子，表明蛋白質 W 所產生嘅間隙可能充當醌通道。
LH114-W 環嘅間隙令到 RC-LH114-W 複合物嘅內部空間同大膜之間形成一個連續嘅膜區域（圖1G ），而唔係好似蛋白質噉透過蛋白質孔連接兩個結構域。 RC-LH116複合物同閉合嘅 Tch 相似。針狀複合物（22）（圖1H ）。由於醌穿過膜嘅擴散比穿過窄蛋白質通道嘅擴散快，所以開放嘅 LH114-W 環可以比閉合嘅 LH116環容許更快嘅 RC 轉化，而醌嘅擴散到 RC 可能會更加受到限制。為咗測試蛋白質 W 係咪影響醌透過 RC 嘅轉化，我哋喺一定濃度嘅泛醌2（ UQ2）（天然 UQ10嘅类似物，异戊二烯尾較短）上進行細胞色素氧化測定（圖2E ）。雖然螯合醌嘅存在阻礙咗表觀米氏常數嘅準確測定（ RC-LH114-W 同 RC-LH116分別適合0.2 ± 0.1 μ M 同 0.5 ± 0.2 μ M ），但係 RC-LH114-W 嘅最大速率（4.6±0.2 e-RC-1）大過28s-15 % RC-LH116（3.6±0.1 e-RC-1 s-1）。
我哋最初估計蛋白質 -W 存在於大約10 % 嘅核心複合物（16）；喺呢度，低光、中光同高光生長細胞嘅佔有率分別係15 ± 0.6 % 、11 ± 1 % 同0.9 ± 0.5 % （圖2F ）。質譜嘅定量比較顯示，同野生型菌株相比，加入組氨酸標籤並冇降低蛋白質 -W 嘅相對丰度（ P = 0.59），所以呢啲水平唔係修飾蛋白質 -W 嘅神器（圖 S10）。然而，呢種低蛋白質 -W 喺 RC-LH1複合體中嘅佔有率可能令到部分 RC 以加速嘅速率翻轉，從而緩解 RC-LH116複合體中較慢嘅醌/喹諾酮交換。我哋留意到高光佔有率同最近嘅轉錄組學數據唔一致，表明 pufW 基因表達喺強光下會增加（圖 S11）（23）。 pufW 轉錄同蛋白質 -W 納入 RC-LH1複合體之間嘅差異令人困惑，亦可能反映咗蛋白質嘅複合體調節。
喺 RC-LH114-W 入面，6個心脂蛋白（ CDL ）、7個磷酸膽鹼（ POPC ）、1個磷酸甘油（ POPG ）同29個 β -DDM 分子被分配同建模喺佢入面6個 CDL 、24個 POPC 、2個 POPG 同12個 βDDM 。 RC-LH116（圖5， A 同 B ）。喺呢兩個結構入面 , CDL 幾乎位於複合體嘅細胞質側，而 POPC 、 POPG 同 β-DDM 大多位於腔側。喺 RC-LH114-W 複合物嘅 α β -1至 α β -6區域分離出兩個脂質同洗滌劑分子（圖5A ），同埋喺 RC-LH116嘅等效區域分離出五個（圖5B ）。喺複合體嘅另一邊發現咗更多嘅脂質，主要係 CDL ，喺 RC 同 α β -7至 α β -13之間累積（圖5、 A 同 B ）。其他結構解析嘅脂質同洗滌劑位於 LH1環外面，而解析良好嘅酰基鏈喺 LH1亞基之間延伸，暫時喺 RC-LH114-W 中指定為 β-DDM ，喺 RC 中定義為 β-DDM β-DDM 同 POPC-LH116嘅混合物。我哋結構中螯合脂質同洗滌劑嘅相似位置表明佢哋係生理上相關嘅結合位點（圖 S12A ）。 Tch 中等效分子嘅位置亦都有好好嘅一致性。溫柔同 Tv 。 970個 RC-LH1菌株（圖 S12， B 至 E ）（9，12）同脂質頭基嘅氫結合殘基喺序列對齊中顯示出相當好嘅保存（圖 S13），表明同 RC 結合嘅保守 CDL （24），呢啲位點可能喺 RC-LH1複合體中保存。
（ A 同 B ） RC-LH114-W （ A ）同 RC-LH116（ B ）肽係用卡通表示，而顏料係用棒表示，用圖1嘅配色方案。脂質係用紅色顯示，而洗滌劑係用灰色顯示。同 RC QA 同 QB 位點結合嘅 UQ 係黃色，而隔離嘅 UQ 係藍色。 （ C 同啲）同（ A ）同（ B ）相同嘅睇法，但係省略咗脂質。 （ E 至 G ） RC-LH116嘅 Q1（ E ）、 Q2（ F ）同 Q3（ G ）嘅放大圖，有互相影響嘅側鏈。氫鏈係用黑色虛線顯示。
喺 RC-LH116入面，參與電荷分離過程中電子轉移嘅 RC QA 同 QB UQ 都會喺佢哋嘅結合位點分解。但係喺 RC-LH114-W 入面， QB 醌仲未解決，下面會詳細討論。除咗 QA 同 QB 醌之外，兩個螯合嘅 UQ 分子（位於 RC 同 LH1環之間）會根據佢哋嘅分辨良好嘅頭基（分別位於 Q1同 Q2）喺 RC-LH114-W 結構中分配。空間）。圖5C ）。兩個异戊二烯單位分配畀 Q1，而密度圖就解析出 Q2嘅完整10個异戊二烯尾。喺 RC-LH116嘅結構中，三個螯合嘅 UQ10分子（ Q1至 Q3，圖5D ）被解析，而所有分子喺整個尾部都有清晰嘅密度（圖5，啲至 G ）。喺兩個結構入面， Q1同 Q2嘅醌頭基團嘅位置有極好嘅一致性（圖 S12F ），而且佢哋只係同 RC 相互作用。 Q1位於 RC-LH114-W 嘅 W 間隙入口（圖1G 同5、 C 、啲同 E ），而 Q2位於 QB 結合位點附近（圖5、 C 、啲）同 F ）。保守嘅 L-Trp143同 L-Trp269殘基非常接近 Q1同 Q2，並且提供潛在嘅 π 堆疊相互作用（圖5、 E 同 F ，同埋圖 S12）。 L-Gln88，距離 Q1嘅遠端氧3.0 Å ，提供強嘅氫鍵（圖5E）；除咗最遠嘅關係之外，呢個殘基喺所有 RC 都係保守嘅（圖 S13）。 L-Ser91係大部分其他 RC 中保守地取代 Thr （圖 S13），同 Q1嘅甲基氧相差3.8埃，亦可能提供弱嘅氫鍵（圖5E ）。 Q3似乎冇特定嘅相互作用，但係位於 RC-M 亞基同 LH1-α 亞基5至6之間嘅疏水區域（圖5、啲同 G ）。 Q1、 Q2同 Q3或者附近嘅螯合醌亦都喺 Tch 中被解決。溫柔，Trv 。 970菌株同 Blc 。虹膜結構（9、10、12）指向 RC-LH1複合體中一個保守嘅輔助醌結合位點（圖 S12G ）。 RC-LH116中嘅五個分解嘅 UQ 同高效液相色譜（ HPLC ）測定嘅每個複合物嘅5.8 ± 0.7非常一致，而 RC-LH114-W 中嘅三個分解嘅 UQ 低於測量值 6.2 ± 0.3（圖 S14），表明有未解決嘅分子結構。
偽對稱嘅 L 同 M 多肽各自含有五個 TMH ，並形成一個異二聚體，結合咗一個 BChl 二聚體、兩個 BChl 單體、兩個噬菌體（ BPh ）單體，同埋一個非血紅素鐵同一個或者兩個 UQ10分子。透過末端酮基上存在氫鏈同埋佢喺 Rps 嘅已知累積，類胡蘿蔔素會被納入 M- 亞基，呢個亞基被命名為順 -3，4- 脫氫荷多平。物種（25）。 RC-H 嘅外膜網域係由單一 TMH 錨定喺膜上面。整體 RC 結構同相關物種（例如 Rba ）嘅三個亞基 RC 相似。球形體（ PDB ID ：3I4D ）。 BChl 同 BPh 嘅大環、胡蘿蔔素骨幹同非血紅素鐵喺呢啲結構嘅分辨率範圍內重疊， QA 位點嘅 UQ10頭基同 RC-LH116嘅 QB 醌都係咁（圖 S15）。
兩種具有唔同 QB 位點佔有率嘅 RC 結構嘅可用性提供咗一個新嘅機會去檢查隨住 QB 醌結合嘅一致構象變化。喺 RC-LH116複合物入面， QB 醌位於完全結合嘅「近端」位置（26），但係 RC-LH114-W 嘅分離就冇 QB 醌。 RC-LH114-W 入面冇 QB 醌，呢個係令人驚訝嘅，因為呢個複合物係有活性嘅，比起有結構分解嘅 QB 醌嘅 RC-LH116複合物更加活躍。雖然兩個 LH1環螯合咗大約六個醌，但係喺閉合嘅 RC-LH116環中有五個係結構上解決嘅，而只有三個喺開放嘅 RC-LH114-W 環中係結構上受到限制。呢種增加嘅結構障礙可能反映咗 RC-LH114-W QB 位點嘅替代速度更快，複合體中嘅醌動力學更快，同埋穿過 LH1環嘅可能性增加。我哋建議 RC-LH114-W 嘅 RC QB 位點缺乏 UQ 可能係一個更複雜同更活躍嘅複合體嘅結果，而 RC-LH114-W 嘅 QB 位點喺 UQ 轉換中已經被立即凍結。特定階段（ QB 位點嘅入口已經關閉）反映咗呢個活性嘅構象。
如果冇 QB ， L-Phe217會隨之旋轉到一個同 UQ10結合唔相容嘅位置，因為佢會同尾部嘅第一個異戊二烯單位引起空間碰撞（圖6A ）。另外，明顯嘅主要構象變化係明顯嘅，特別係螺旋 de （ TMH 啲同 E 之間嘅環中嘅短螺旋），當中 L-Phe217會移動到 QB 結合兜，同埋 L-Tyr223嘅旋轉（圖6A），以打破同 M-Asp45框架嘅氫鏈，並關閉 QB 結合位點嘅入口（圖6B ）。螺旋喺佢嘅底部轉軸， L-Ser209嘅 C α 移位0.33 Å ，而 L-Val221C α 移位3.52 Å 。 TMH 啲同 E 冇可觀察嘅變化，而呢兩種變化係兩個結構都可以重疊嘅（圖6A ）。據我哋所知，呢個係天然 RC 入面第一個關閉 QB 地點嘅結構。同完整（ QB 結合）結構嘅比較顯示，喺醌被還原之前，需要一個構象變化先可以令佢進入醌。 L-Phe217旋轉，同喹酮頭基形成 π 堆疊相互作用，而螺旋向外移動，令 L-Gly222嘅骨架同 L-Tyr223嘅側鏈形成一個具有穩定氫鏈結構嘅氫鏈網絡（圖6， A 同 C ）。
（ A ）全息圖（ L 鏈、橙色 / M 鏈、洋紅色）同 apo （灰色）結構嘅重疊卡通，其中關鍵殘基以棒狀表示嘅形式顯示。 UQ10係用黃色條表示。虛線係指整個結構中形成嘅氫鏈。 （ B 同 C ）脫脂蛋白同整個環結構嘅表面表示，分別突顯藍色嘅 L-Phe217同紅色嘅 L-Tyr223嘅側鏈氧。 L 亞基係橙色； M 同 H 亞基係冇色嘅。 （啲同 E ）脫脂蛋白（啲）同全（ E ） RC QB 位點［分別由（ A ）顏色］同嗜熱菌 PSII （綠色、藍色同塑膠醌； PDB ID ：3WU2）對齊（58）。
估唔到，雖然有幾種冇 LH1嘅 QB 缺乏 RC 結構可用，但係呢個研究中所觀察到嘅構象變化之前並冇報導過。呢啲包括嚟自 Blc 嘅 QB 耗盡結構。維里迪斯（ PDB ID ：3PRC）（27）， Tch 。泰皮杜姆（ PDB ID ：1EYS）（28）同 Rba 。球體（ PDB ID ：1OGV ）（29），佢哋全部都同佢哋嘅整體 QB 結構幾乎一樣。密切檢查3PRC 發現 LDAO （月桂基二甲基氧化胺）洗滌劑分子會喺 QB 位置嘅入口結合，可能會阻止重新排列成閉合架構。雖然 LDAO 喺1EYS或者1OGV入面唔會喺同一個位置分解，但係呢啲 RC 係用相同嘅洗滌劑整嘅，所以可能會產生相同嘅效果。 Rba 嘅結晶結構。同細胞色素 c2共結晶嘅球狀體 RC （ PDB ID ：1L9B ）亦都似乎有一個閉合嘅 QB 位點。然而，喺呢個情況下， RC-M 多肽嘅 N 末端區域（透過 Q 螺旋上嘅 Tyr 殘基嘅 H 鏈同 QB 結合位點相互作用）採用咗一個唔自然嘅構象，而 QB 構象嘅變化並冇進一步探討（30）。令人放心嘅係，我哋喺 RC-LH114-W 結構入面冇見過呢種 M 多肽嘅變形，呢個變形同 RC-LH116 RC 嘅 N 末端區域幾乎一樣。亦都應該要留意嘅係，喺根除咗基於洗滌劑嘅 LH1天線之後， PDB 入面嘅脫脂蛋白 RC 就被解決咗，呢個就消除咗 RC 同周圍 LH1環嘅內表面之間嘅間隙入面嘅內部醌池同脂質（31，32）。 RC 仍然有功能，因為佢保留咗所有輔因子，除咗可分解嘅 QB 醌，佢穩定性較低，而且喺製備過程中經常會流失（33）。另外，已知喺 RC 中去除 LH1同天然環狀脂質可以對功能有影響，例如電荷分離嘅 P + QB 狀態嘅壽命縮短（31、34、35）。所以，我哋推測 RC 周圍嘅局部 LH1環嘅存在可能會維持「閉合」嘅 QB 位點，從而保留 QB 附近嘅局部環境。
雖然脫脂蛋白（冇 QB 醌）同完整結構只係代表 QB 位點轉移嘅兩個快照，而唔係一連串嘅事件，但係有跡象顯示呢個結合可以被閘控，以防止氫醌再結合，以抑制底物抑制。喺脫脂蛋白嘅 QB 位點附近嘅喹諾洛同醌嘅相互作用可能唔同，導致佢被 RC 拒絕。早已有人提出，構象變化會喺醌嘅結合同還原中發揮作用。凍結嘅 RC 喺暗適應後減少醌嘅能力受損（36）； X 射線結晶學顯示呢種損傷係因為 QB 醌被困喺距離活性近端位置大約4.5 Å 嘅「遠端」架構（26），37）。我哋建議呢個遠端結合架構係脫脂蛋白同全環結構之間嘅中間狀態嘅快照，呢個係跟住同醌嘅初始相互作用同埋 QB 位點嘅開放。
喺某啲光補細菌同藍藻、藻類同植物嘅 PSII 複合物中發現嘅 II 型 RC 有結構同功能保存（38）。圖6（啲同 E ）所示嘅結構對齊強調咗 PSII RC 同細菌 RC 複合體嘅 QB 位點之間嘅相似性。呢個比較早已成為研究醌結合同還原嘅密切相關系統嘅模型。先前嘅出版物表明，構象變化會伴隨住醌嘅 PSII 還原（39，40）。因此，考慮到 RC 嘅進化保存，呢個之前未觀察到嘅結合機制亦可能適用於氧化光補植物中 PSII RC 嘅 QB 位點。
Rps Δ pufW （未標記嘅 pufW 缺失）同 PufW-His （ C 末端10x His 標記蛋白 -W 由天然 pufW 基因座表達）菌株。帕魯斯特 CGA009係我哋之前嘅研究入面描述過嘅（16）。呢啲菌株同同基因野生型親本係喺 PYE （每5克升 -1）（儲存喺 -80 °C 嘅 LB 中，含有 50 % （ w / v ）甘油）蛋白、酵母提取物同琥珀酸 [1.5 % （ w / v ） ] 板上嘅少量細胞，喺冰箱中回收。將板喺厭氧條件下，喺室溫下喺暗處孵育過夜，然後用 OSRAM 116-W 卤素球（英國 RS Components ）提供嘅白光（ ~ 50 μmolm-2 s-1）照射3至5日，直至出現單一菌落。單一菌落用嚟接種10毫升嘅 M22 + 培養基（41），培養基中補充咗0.1 % （ w / v ）酪胺酸（以下簡稱 M22）。將培養物喺34 °C 嘅低氧條件下，以180 rpm 嘅速度搖晃，喺低氧條件下生長48小時，然後將70毫升嘅培養物喺相同條件下接種24小時。用體積為1毫升嘅半有氧培養液將30毫升嘅 M22培養基接種喺30毫升通用螺旋頂透明玻璃樽入面，然後用無菌磁力攪拌棒（~50μmolm-2 s-1）照射48小時。然後，喺相同條件下，將30毫升嘅培養物同約1升嘅培養物接種，然後用嚟接種約9升嘅培養物，用 ~200 μmolm-2 s-1照明，持續72小時。細胞係喺7132 RCF 下離心30分鐘收集，重懸浮喺~10毫升20毫升三 HCl （ pH 8.0）中，然後儲存喺 -20 ° C 直至需要。
解凍後，將一啲脫氧核糖核酸酶 I （默克，英國）嘅結晶、溶菌酶（默克，英國）同兩粒羅氏全酶蛋白酶抑制劑片（默克，英國）加入重懸浮嘅細胞。喺一個 20,000 psi 嘅法國壓力電池（美國 Aminco ）入面，將啲電池破壞咗8至12次。喺4 °C 下以18，500 RCF 離心15分鐘去除未破碎嘅細胞同唔溶嘅碎片之後，喺43，000 °C 下以113，000 RCF 離心2個鐘，將膜從色素裂解物中沉澱出嚟。棄置可溶部分，將有色膜重懸浮於 100 至 200 ml 20 mM tris-HCl （ pH 8.0）中，並均質化直至冇可見嘅聚集體。將懸浮膜喺含有2 %（ w / v ） β -DDM 嘅20 mM tris-HCl （ pH 8.0）（美國阿納特拉斯）中，喺4 °C 嘅暗處，輕輕攪拌下溫育1小時。然後喺70℃下離心，喺4℃下溶解15萬個 RCF 1個鐘，以除去殘留嘅不溶物。
將來自 ΔpufW 菌株嘅溶解膜施加到50 ml DEAE Sepharose 離子交換柱上，並加入三個柱體積（ CV ）嘅結合緩衝液［20 mM tris-HCl （ pH 8.0），含有0.03 % （ w / v ） β -DDM ］。用兩種 CV 結合緩衝液洗淨柱，然後用兩種含有50 mM NaCl 嘅結合緩衝液洗淨柱。 RC-LH116複合物用150至300 mM NaCl （喺結合緩衝液中）嘅線性梯度喺1.75 CV 上洗脫，而剩餘嘅結合複合物用含有300 mM NaCl 嘅結合緩衝液喺0.5 CV 上洗脫。收集250至1000 nm 之間嘅吸收光譜，將吸光度比（ A880/A280）大於1嘅組分保持喺880至280 nm ，喺結合緩衝液中稀釋兩次，然後喺 DEAE 柱上再次使用相同嘅程序進行純化。將 A880/A280比例高於1.7同 A880/A805比例高於3.0嘅組分稀釋，進行第三輪離子交換，並保留 A880/A280比例高於2.2同 A880/A805比例高於5.0嘅組分。將部分純化嘅複合物喺 Amicon 10萬分子量截止（ MWCO ）離心過濾器（英國默克）中濃縮至 ~ 2 ml，然後載入含有200 mM NaCl 緩衝液嘅 Superdex 20016/600尺寸排除柱（美國 GE Healthcare ），然後喺同一個緩衝液中洗脫。收集尺寸排除組分嘅吸收光譜，並將吸收光譜濃縮到 A880/A280比例超過2.4，同埋 A880/A805比例超過5.8至100 A880，然後立即用佢哋嚟做低溫 TEM 格製備或者儲存保持喺 -80 ° C 直至需要。
將 PufW-His 菌株嘅溶解膜施加喺 IMAC 緩衝液（ GE 醫療保健）中嘅20毫升 HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 柱（20 mM 三 HCl （ pH 8.0），含有200 mM NaCl 同0.03 % （ w / w ））。 v ） β -DDM ］。柱用五個 CV 嘅 IMAC 緩衝液洗淨，然後用五個含有 10 mM 組氨酸嘅 IMAC 緩衝液洗淨。用含有 100 mM 組氨酸嘅 5 個 IMAC 緩衝液從柱中洗脫核心複合物。將含有 RC-LH114-W 複合物嘅組分喺配備 Amicon 100,000 MWCO 過濾器（英國默克）嘅攪拌缸中濃縮至 ~ 10毫升，用結合緩衝液稀釋20倍，然後加入25毫升嘅 DEAE Sepharose 柱中，預先使用四個結合緩衝液嘅 CV 。用四種 CV 結合緩衝液洗淨柱，然後用 0 至 100 mM NaCl 嘅線性梯度（喺結合緩衝液中）洗脫八個 CV 上嘅複合物，而其餘四個含有 100 mM 結合緩衝液嘅 CV ~ 2 ml 喺 Amicon 100，000 MWCO 離心過濾器入面，並預先用緩衝液平衡嘅 Superdex 20016/600尺寸排除柱填充1.5 CV IMAC ，然後喺1.5 CV 嘅同一緩衝液中洗脫。收集大小排除組分嘅吸收光譜，並將吸收光譜濃縮到 A880/A280比例超過2.1，同埋 A880/A805比例超過4.6至100 A880，呢啲吸收光譜會即刻用嚟做冷凍 TEM 格製備，或者儲存喺 -80 °C 直至需要。
我哋用咗 Leica EM GP 浸泡式凍庫嚟整低溫 TEM 格。將複合物喺 IMAC 緩衝液中稀釋至50嘅 A880，然後將5μl載入新嘅發光放電嘅 QUANTIFOIL 1.2/1.3碳塗層銅網（英國琥珀科學公司）上。將格喺20 °C 同60 % 相對濕度下溫育30秒，然後將佢印乾3秒，然後喺 -176 °C 嘅液體乙烷中淬火。
RC-LH114-W 複合物嘅數據係用 Titan Krios 顯微鏡喺 eBIC （電子生物成像中心）（英國鑽石光源）上面記錄，呢個顯微鏡喺300kV 嘅加速電壓下，標稱放大率係130,000 × ，能量係20 eV 。我哋用咗一個帶有 K2峰探測器嘅 Gatan 968 GIF 量子嚟以計數模式記錄圖像嚟收集數據。校準像素大小為1.048Å，劑量率為3.83 e-Å-2s-1。喺11秒內收集咗套電影，並將佢分成40個部分。用碳塗層區域重新對焦顯微鏡，然後每個孔收集三張電影。總計收集咗3130部電影，散焦值介乎 -1 至 -3 μ m 之間。
RC-LH116複合物嘅數據係用同一個顯微鏡喺阿斯特伯里生物結構實驗室（英國利茲大學）收集。數據係喺放大130 k 嘅計數模式下收集，而像素大小係用4.6 e-Å-2s-1嘅劑量校正到1.065 Å 。電影用咗12秒錄製，分咗48個部分。總計收集咗3359張膜，散焦值介乎 -1 至 -3 μ m 之間。
所有資料處理都係喺 Relion 3.0管道（42）中進行。使用 Motioncorr 2（43）透過劑量加權校正光束運動，然後使用 CTFFIND 4.1（44）嚟確定 CTF （對比度轉移函數）參數。呢啲初始處理階段之後嘅典型顯微鏡相片如圖2所示。 S16。自動選擇模板係透過喺250像素嘅框架入面手動選擇大約250個像素嘅1000個粒子，而冇參考二維（2D）分類，從而拒絕嗰啲符合樣本污染或者冇可辨識特性嘅分類。然後，對所有顯微鏡照片進行自動選擇， RC-LH114-W 係849，359個粒子，而 RC-LH116複合物係476，547個粒子。所有選定嘅粒子都經過咗兩輪非參考2D分類，而每次跑完之後，符合碳面積、樣本污染、冇明顯特徵或者強烈重疊嘅粒子嘅粒子都會被拒絕，結果係772，033（90.9 % ）同359，678（75.5 % ）嘅粒子分別用嚟做4L-W161116嘅3D分類。初始3D 參考模型係用隨機梯度下降法生成。以初始模型為參考，喺3D 中將所選粒子分為四個類別。用呢個類別嘅模型作為參考，對最大類別嘅粒子進行3D 精煉，然後用初始嘅15Å低通濾波器去覆蓋溶劑區域，加入6個像素嘅軟邊緣，然後對像素進行後處理，以校正 Gatan K2峰頂探測器嘅調變轉移函數。對於 RC-LH114-W 數據集，呢個初始模型係透過移除掩模邊緣嘅強密度（同 UCSF Chimera 嘅核心複合物密度斷開）嚟修改。所得嘅模型（ RC-LH114-W 同 RC-LH116嘅分辨率分別係3.91同4.16 Å ）用作第二輪3D分類嘅參考。所用嘅粒子係分組喺初始嘅 3D 級別，同鄰近嘅粒子唔包含強烈嘅相關性。重疊或者缺乏明顯嘅結構特徵。喺第二輪3D分類之後，揀咗最高分辨率嘅類別［對於 RC-LH114-W ，一個類別係377，703個粒子（44.5 % ），對於 RC-LH116，有兩個類別，總共260，752個粒子（54.7 % ），其中佢哋只係喺同一個細嘅差異對齊之後嘅初始值相同］。所選嘅粒子會喺400像素嘅盒子入面重新提取，然後透過3D 精煉精煉。溶劑掩模係用初始15Å低通濾波器、3像素圖擴展同3像素軟掩模生成。利用每粒子 CTF 細化、每粒子運動校正同埋第二輪每粒子 CTF 細化，每個步驟之後都會進行3D 細化、溶劑遮蔽同後處理，以進一步細化所得嘅紋理。使用 FSC （傅立叶壁相關係數）截止值0.143， RC-LH114-W 同 RC-LH116嘅最終模型嘅分辨率分別係2.65同2.80 Å 。最終模型嘅 FSC 曲線如圖2所示。 S17。
所有蛋白質序列都係由 UniProtKB 下載： LH1- β （ PufB ； UniProt ID ： Q6N9L5）； LH1- α （ PufA ；單蛋白 ID ： Q6N9L4）； RC-L （ PufL ； UniProt ID ： O83005 ）； RC-M （ PufM ； UniProt ID ： A0A4Z7 ）； RC-H （ PuhA ； UniProt ID ： A0A4Z9 ）；蛋白質 -W （ PufW ；單蛋白質 ID ： Q6N1K3）。我哋用咗 SWISS-MODEL （45）去構建 RC 嘅同源模型，當中包含 RC-L 、 RC-M 同 RC-H 嘅蛋白質序列同埋 Rba 嘅結晶結構。球形 RC 係用嚟做模板（ PDB ID ：5LSE ）（46）。使用 UCSF Chimera 入面嘅「擬合圖」工具將生成嘅模型擬合到圖（47），改善蛋白質結構，同埋使用輔因子［4 × BChl a （單體庫殘基名稱 = BCL ）、 2 × BPh a （ BPH ）、一種或兩種 UQ10（ U10 ）、一種非血紅素鐵（ Fe ）同一種 3,4-2 碳氫乙二醇（ Co2 ） （48）要加。由於 QAK 喺單體庫入面唔可以用，所以用 PHENIX 入面嘅 eLBOW 工具去參數化佢（49）。
接下來，構建咗 LH1亞基。最初，用咗 PHENIX （49）入面嘅自動構建工具，用地圖同埋 LH1- α 同 LH1- β 蛋白質序列作為輸入，自動構建部分 LH1序列。選擇最完整嘅 LH1亞基，將佢提取同載入 Coot ，手動加入佢入面嘅缺失序列，然後手動細化整個結構，然後加入兩個 BCls a （ BCL ）同一個螺黃素（ CRT ）［根據相關嘅 Rps LH1複合物嘅密度同已知嘅胡蘿蔔素含量。物種（17）］。複製完整嘅 LH1亞基，然後用 UCSF Chimera 「對接地圖工具」去對接 LH1密度嘅鄰近非模型區域，然後喺 Coot 度細化佢；重複呢個過程，直至所有 LH1亞基都被建模為止。對於 RC-LH114-W 結構，透過提取 Coot 入面嘅未分配密度，將蛋白質由 USCF Chimera 圖入面嘅剩餘非蛋白質成分分割出嚟，然後用 Autobuild 工具去建立初始模型，同埋用嚟建立剩餘嘅亞基（蛋白質 -W ）建模。喺《鳳凰》（49）入面。將任何缺失嘅序列加入 Coot （48）嘅所得模型，然後手動細化整個亞基。剩餘嘅未分配密度適合脂質嘅組合（ CDL 嘅 PDB 單體庫 ID = CDL 、 POPC = 6PL 同 POPG = PGT ）、 β -DDM 洗滌劑（ LMT ）同 UQ10分子（ U10）。用 PHENIX 優化（49）同 Coot （48）嘅手動優化去完善完整嘅初始模型，直至模型統計數據同擬合嘅視覺質素唔能夠進一步改善。最後，用 LocScale （50）去銳化局部地圖，然後進行其他幾個循環，建模未分配嘅密度同埋自動同手動優化。
各自嘅肽、輔因子同其他脂質同醌對接喺佢哋各自嘅密度之內，如圖1同圖2所示。 S18至 S23。最終模型嘅統計資料如表 S1所示。
除非另有規定，否則紫外線/可見光/近紅外線吸收光譜係喺 Cary60分光光度計（美國安捷倫）上，以250 nm 至1000 nm 嘅1 nm 間隔收集，積分時間係0.1s。
將試料放入石英比色皿中，用2毫米路徑稀釋到1嘅 A880，然後收集400至1000納米之間嘅吸收光譜。圓形二向色光譜係喺 Jasco 810分光極性計（ Jasco ，日本）上，以 1 nm 嘅間隔，喺400 nm 至 950 nm 之間，以20 nm min-1 嘅掃描速率收集。
摩爾消光係數係透過將核心複合物稀釋到大約50嘅 A880嚟確定。將10 μ l 體積稀釋喺990 μ l 結合緩衝液或甲醇中，然後立即收集吸收光譜，以最大程度減少 BChl 嘅降解。每個甲醇樣本嘅 BChl 含量係用54.8 mM-1 cm-1嘅771 nm 消光係數計算出嚟，並測定消光係數（51）。將測量到嘅 BChl 濃度除以32（ RC-LH114-W ）或者36（ RC-LH116）嚟確定核心複合物濃度，然後用呢個濃度嚟決定喺緩衝液入面收集嘅同一樣本嘅吸收光譜消光係數。平行。每個樣本重複測量三次，並用 BChl Qy 最大值嘅平均吸光度嚟計算。 RC-LH114-W喺878nm嘅消光係數係3280±140 mM-1 cm-1，而RC-LH116喺880nm測量嘅消光係數係3800±30 mM-1 cm-1。
根據（52）中嘅方法量化 UQ10。總之，反相 HPLC （ RP-HPLC ）係用安捷倫1200 HPLC 系統進行。將約 0.02 nmol RC-LH116或 RC-LH114-W 溶解喺50μl 50:50甲醇：氯仿含有0.02 % （ w / v ）氯化鐵嘅 PLC 中，然後注入預先平衡嘅貝克曼庫爾特超球 ODS 4.6 ml-10 分鐘溶液（80:20甲醇：2-丙醇）喺 ×25厘米柱上面。喺 HPLC 溶劑中進行等度洗脫，以監測275納米（ UQ10 ）、450納米（胡蘿蔔素）同780納米（ BChl ）嘅吸光度，持續1個鐘。積分咗25.5分鐘嘅275 nm 色譜中嘅峰，當中冇任何其他可檢測嘅化合物。積分面積係用嚟參考由0至5.8 nmol 嘅純標準注入計算出嚟嘅校正曲線，計算出提取出嚟嘅 UQ10摩爾量（圖 S14）。每個樣本都分析咗三次重複，而報告嘅誤差對應平均值嘅 SD 。
用30 μM 還原馬心臟細胞色素 c2（英國默克）同0至50 μMUQ2（英國默克）製作含有最大 Qy 吸收0.1嘅 RC-LH1複合物嘅溶液。以每個 UQ2濃度製作三個1毫升樣本，並喺4 °C 嘅黑暗中溫育過夜，以確保喺測量前完全適應黑暗。將溶液載入一個 OLIS RSM1000模塊化分光光度計，個分光光度計配備咗300納米火焰/500線光柵，1.24毫米入口，0.12毫米中間同0.6毫米出口狹窄。喺樣本光管同參考光電倍增管嘅入口位置放置咗一個600 nm 長通濾波器，以排除激發光。吸光度係喺550 nm 監測，積分時間係0.15秒。激發光係由880 nm M880F2 LED （發光二極體）（英國 Thorlabs 有限公司）透過一條光纖電纜以90 % 強度透過 DC2200控制器（英國 Thorlabs 有限公司）發射，並以90 ° 嘅角度發射到光源。測量光束同鏡子相反，以返回任何最初未被樣本吸收嘅光線。喺照度50秒之前10秒監測吸光度。然後喺黑暗中進一步監測吸光度60秒，以評估喹諾洛自發降低細胞色素 c23 + 嘅程度（原始數據請睇圖 S8）。
數據係透過擬合0.5至10秒內嘅線性初始速率（視乎 UQ2濃度），同埋將三個樣本喺每個 UQ2濃度下嘅速率平均嚟處理。由各自嘅消光係數計算出嚟嘅 RC-LH1濃度用嚟將速率轉換成催化效率，喺 Origin Pro 2019（美國 OriginLab ）繪製，並擬合到 Michaelis-Menten 模型嚟確定表觀 Km 同 Kcat 值。
對於瞬時吸收測量，將 RC-LH1樣本喺含有50 mM 抗壞血酸鈉（美國默克）同0.4 mM 特布汀（默克，美國）嘅 IMAC 緩衝液中稀釋至 ~ 2 μ M 。抗壞血酸係用作犧牲電子供體，而叔丁氯芬係用作 QB 抑制劑，以確保主要嘅 RC 供體喺整個測量過程中保持還原（即係唔會被光氧化）。將大約3毫升嘅樣本加入到一個光路長度為2毫米嘅定制旋轉電池（直徑約0.1米，350轉），以確保激光路徑中嘅樣本有足夠時間喺激發脈衝之間進行暗適應。使用 ~100 fs 激光脈衝放大 Ti: 藍寶石激光系統（美國光譜物理公司），以1 kHz 嘅重複率喺880 nm 激發試料（近紅外線係20 nJ，可見光係100 nJ）。喺收集數據之前，將樣本暴露喺激發光下大約30分鐘。接觸會導致 QA 失活（可能會減少一至兩次 QA ）。但請注意，呢個過程係可逆嘅，因為經過長時間嘅暗適應， RC 會慢慢返去 QA 活動。我哋用咗 Helios 光譜計（美國超快系統）嚟測量瞬態光譜，延遲時間係 -10 至 7000 ps 。使用 Surface Xplorer 軟件（美國超快系統）將數據集解組，然後合併同標準化。使用 CarpetView 軟件包（ Light Conversion Ltd . ，立陶宛）使用組合數據集嚟獲得同衰變相關嘅微分光譜，或者用一個將多個指數同儀器响應卷積嘅函數，嚟擬合 Origin （美國 OriginLab ）嘅單波長光譜演化。
如上所述（53），製作咗一種含有 LH1複合體嘅光合膜，缺乏 RC 同外圍 LH2天線。將膜稀釋喺20 mM tris （ pH 8.0）中，然後載入一個有2 mm 光路嘅石英比色皿。 30nJ 激光脈衝係用嚟喺540 nm 激發試料，延遲時間係 -10至7000 ps 。按照 Rps 嘅描述處理數據集。朋友樣本。
將膜喺4 °C 下以150，000 RCF 離心2小時，然後將佢喺880 nm 嘅吸光度重懸浮喺20 mM tris-HCl （ pH 8.0）同200 mM NaCl 中。喺4 °C 嘅暗處，慢慢用2 % （ w / v ） β -DDM 攪拌1個鐘，溶解膜。將樣本用100 mM 碳酸三乙銨（ pH 8.0）（ TEAB ；默克，英國）稀釋至蛋白質濃度2.5 mg ml-1（ Bio-Rad 分析）。進一步嘅處理方法係根據之前發表嘅方法（54）進行，首先將50 μg 蛋白質稀釋成總共50 μl 含有1 % （ w / v ）月桂酸鈉嘅 TEAB （默克，英國）。超聲波60秒後，用5 mM 三（2-羧乙基）膦（默克，英國）喺37 °C 下還原30分鐘。對於 S- 烷基化，將試料用10 mM 甲基 S- 甲基硫代甲磺酸鹽（默克，英國）溫育，然後喺室溫下由200 mM 異丙醇原液加入10分鐘。蛋白質溶解消化係加入2 μg 胰蛋白酶/內蛋白酶 Lys-C 混合物（ Promega UK ），並喺37 °C 下溫育3小時。加入50 μl 乙酸乙酯同10 μl 10 % （ v / v ） LC 級三氟乙酸（ TFA ；英國熱費爾科學公司），並漩渦60秒，提取月桂酸表面活性劑。以15，700 RCF 離心5分鐘促進相分離。根據製造商嘅方案，用 C18自旋柱（英國熱費雪科學公司）小心吸取同脫鹽含有肽嘅下相。真空离心乾燥後，將試料溶解喺0.5 % TFA 同3 % 乙腈中，然後用之前詳細講嘅系統參數，用納米流 RP 色譜結合質譜分析500 ng 。
使用 MaxQuant v .1.5.3.30（56）進行蛋白質驗證同定量嚟搜尋 Rps 。蛋白質組資料庫（ www . uniprot . org/ 蛋白質組 / UP000001426）。質譜蛋白質組學數據已經透過 PRIDE 合作夥伴存儲庫（ http : / / proteomecentral . proteomexchange . org ）存入蛋白質組交換聯盟，資料集識別碼為 PXD020402。
為咗用 RPLC 同電噴電離質譜法進行分析， RC-LH1複合物係由野生型 Rps 製備。用之前發表過嘅方法（16），喺20毫升嘅 Hepes （ pH 7.8）中，100毫升嘅氯化鈉同0.03 % （ w / v ） β - （ Bio-Rad 分析）） DDM 中產生嘅蛋白質濃度係2 mg ml-1。根據製造商嘅方案，用2D純化試劑盒（美國GE Healthcare）用沉澱法提取10 μ g 蛋白質，然後將沉澱物溶解喺20 μl 60 % （ v / v ）甲酸（ FA ）、20 % （ v / v ）乙腈同20 % （ v / v ）水中。用 RPLC （ Dionex RSLC ）結合質譜（ Maxis UHR-TOF ，布魯克）分析咗五微升。使用 MabPac 1.2 × 100 mm 柱（英國熱費爾科學公司）於 60 ° C 同 100 μ lmin -1 下分離，梯度係 85 % （ v / v ）溶劑 A [0.1 % （ v / v ） FA 同 0.02 % （ V / v ） TFA 水溶液（ v / 8 % v ） FA 同90 % （ v / v ）乙腈 TFA 中嘅0.02 % （ v / v ）］使用標準電噴電離源同預設參數超過60分鐘，質譜計得到100至2750 m / z （質電荷比）。喺 ExPASy 生物資訊學資源入口網站 FindPept 工具（ https : / / web . expasy . org / findpept / ）嘅幫助下，將質譜映射到複合體嘅亞單位。
將細胞喺100毫升低低（10μMm-2s-1）、中（30μMm-2s-1）或高（300μMm-2s-1）光下生長72小時。 100 毫升螺旋頂瓶中嘅 M22培養基（ M22培養基，其中省略咗硫酸銨，用醋酸鈉取代琥珀酸鈉）（23）。喺五個30秒嘅循環中，以1:1嘅體積比將0.1微米嘅玻璃珠珠成珠，以溶解細胞，然後喺冰上冷凍5分鐘。喺台式微離心機中，以16，000 RCF 離心10分鐘，去除唔溶性物質、未破碎嘅細胞同玻璃珠。將膜放入 Ti 70.1轉子中，用10萬 RCF 喺20 mM tris-HCl （ pH 8.0）同40/15 % （ w / w ）蔗糖梯度分離10個鐘。
正如我哋之前嘅研究所講， PufW 上嘅 His 標籤嘅免疫檢測（16）。總之，將純化嘅核心複合物（11.8 nM）或者含有相同濃度嘅 RC 嘅膜（由氧化減去降低嘅差光譜同匹配染色凝膠上嘅負荷而決定）喺2x SDS 載荷緩衝液（默克，英國）中稀釋兩次。將啲蛋白質分離喺一個複製嘅12 % 雙三 NuPage 凝膠（英國熱費雪科學公司）上面。用庫馬西亮藍（ Bio-Rad ，英國）染色一個凝膠，以載入同可視化 RC-L 亞基。將第二個凝膠上嘅蛋白質轉移到甲醇活化嘅聚偏二氟乙烯（ PVDF ）膜（英國熱費雪科學公司）進行免疫測定。將 PVDF 膜阻斷喺50 mM 三 HCl （ pH 7.6）、150 mM NaCl 、0.2 % （ v / v ） Tween-20同5 % （ w / v ）脫脂奶粉中，然後用抗His 一抗（喺稀釋抗體緩衝液［50 mM 氯化鈉1.06 p 1.06p NaCl 同250 mM NaCl 0.05 % （ v / v ）吐溫 -20］喺1:1000 A190-114A，美國貝基實驗室）中4個鐘。喺抗體緩衝液中洗滌3次5分鐘之後，將膜同辣根過氧化物酶（ Sigma-Aldrich ，英國）抗小鼠二抗（抗體緩衝液中稀釋1:10，000）結合，使用 WESTAR ETA C 2.0化學發光底物（意大利保健）同60英國）。
透過繪製每個染色凝膠或免疫測定條嘅強度分布，積分峰下嘅面積，並計算 RC-L （染色凝膠）同 Protein-W （免疫測定）嘅強度比，喺 ImageJ （57）中處理圖像。假設純 RC-LH114-W 樣本中 RC-L 同蛋白質 -W 嘅比例係1:1，並相應將整個數據集標準化，將呢啲比例轉換成摩爾比例。
有關呢篇文章嘅補充材料，請睇 http : / / 進步 . 科學雜誌 . org / cgi / 內容 / 完整 / 7 / 3 / eabe2631 / DC1
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大衛 JK 斯溫斯伯里，朴倩，菲利普 J. 積遜，凱特琳 M. 法里斯，達里修斯 M. 尼茲維茲基，伊麗莎白 C. 馬丁，大衛 A. 法默，洛娜 A. 馬龍，麗貝卡 F. 湯普森，尼爾 A. 蘭森，丹尼爾 P 坎尼夫，馬克 J. 迪克曼，杜威霍爾滕， C . 克里斯汀 · 希里奇馬
反應中心嘅光陷阱1複合物嘅高分辨率結構為醌動力學提供咗新嘅見解。
大衛 JK 斯溫斯伯里，朴倩，菲利普 J. 積遜，凱特琳 M. 法里斯，達里修斯 M. 尼茲維茲基，伊麗莎白 C. 馬丁，大衛 A. 法默，洛娜 A. 馬龍，麗貝卡 F. 湯普森，尼爾 A. 蘭森，丹尼爾 P 坎尼夫，馬克 J. 迪克曼，杜威霍爾滕， C . 克里斯汀 · 希里奇馬
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