現 * 現地址：德國科隆50931，科隆卓越集群衰老相關疾病細胞壓力反應研究（ CECAD ）。
線粒體疾病嘅神經退化被認為係不可逆嘅，因為神經元嘅代謝可塑性有限，但係線粒體功能障礙對身體神經元代謝嘅細胞自主性嘅影響仍然係唔太清楚。喺呢度，我哋介紹咗由線粒體融合動力學破壞引起嘅進行性 OXPHOS 缺乏症嘅 Purkinje 神經元嘅細胞特異性蛋白質組。我哋發現線粒體功能障礙引發咗蛋白質組學領域嘅深刻變化，最終導致細胞死亡前精確嘅代謝程序嘅順序激活。估唔到，我哋確定咗丙酮酸羧化酶（ PCx ）同其他補充 TCA 循環中間體嘅抗衰老酶嘅明顯誘導。抑制 PCx 會加劇氧化應激同神經退行性退化，表明動脈粥樣硬化對缺乏 OXPHOS 嘅神經元有保護作用。喺末端退化嘅神經元中恢復線粒體融合會完全逆轉呢啲代謝特性，從而防止細胞死亡。我哋嘅研究結果發現咗以前未知嘅途徑，可以賦予線粒體功能障礙嘅復原力，並且顯示神經退行性即使喺疾病嘅後期都可以逆轉。
線粒體喺維持神經元能量代謝嘅中心作用，係由同人類線粒體疾病相關嘅廣泛神經症狀所強調。呢啲疾病大部分都係由調節線粒體基因表達嘅基因突變（1，2）或者同線粒體動力學有關嘅基因破壞引起，間接影響線粒體 DNA （ mtDNA ）嘅穩定性（3，4）。動物模型嘅研究顯示，因應周圍組織嘅線粒體功能障礙，保守嘅代謝途徑（5-7）可以被激活，呢個為深入理解呢啲複雜疾病嘅病因提供重要嘅資料。與此形成鮮明對比，我哋對由於腦部線粒體三磷酸腺苷（ ATP ）生產嘅一般失敗所引起嘅特定細胞類型嘅代謝變化嘅理解係根本嘅（8），強調需要識別出可以用嚟預防或預防疾病嘅治療靶。預防神經退化（9）。缺乏資料嘅係，神經細胞被廣泛認為同周圍組織嘅細胞類型相比，佢哋嘅代謝靈活性非常有限（10）。鑑於呢啲細胞喺協調向神經元供應代謝物以促進突觸傳遞同對傷害同疾病條件作出反應嘅過程中發揮中心作用，所以將細胞代謝適應腦組織嘅挑戰性條件嘅能力幾乎只限於胶質細胞（11-14）。另外，腦組織固有嘅細胞異質性好大程度上阻礙咗研究特定神經元亞群發生嘅代謝變化。結果，對於神經元線粒體功能障礙嘅確切細胞同代謝後果，我哋所知甚少。
為咗了解線粒體功能障礙嘅代謝後果，我哋分離咗由線粒體外膜融合（ Mfn2）破壞引起嘅神經退化嘅唔同階段嘅浦肯野神經元（ PNs ）。雖然人類嘅 Mfn2突變同一種遺傳性嘅運動感覺神經病有關，呢種病叫做夏科 - 瑪麗 - 牙 2A 型（15），但係喺小鼠身上條件性破壞 Mfn2係一種公認嘅氧化磷酸化（ OXPHOS ）功能障礙嘅誘導方法。各種神經元亞型（16-19）同所產生嘅神經退行性表型都伴隨住進行性嘅神經症狀，例如運動障礙（18、19）或者小腦運動失調（16）。透過結合冇標籤定量（ LFQ ）蛋白質組學、代謝組學、成像同病毒學方法，我哋表明進行性神經退行性會強烈誘導體內丙酮酸羧化酶（ PCx ）同其他參與 PNs 動脈硬化嘅因素嘅表達。為咗驗證呢個發現嘅相關性，我哋特別下調咗 Mfn2 缺乏嘅 PN 中 PCx 嘅表達，並發現呢個操作會加重氧化負擔同加速神經退行，因此證明冇精症會賦予細胞死亡代謝適應性。 MFN2嘅嚴重表達可以完全拯救有嚴重 OXPHOS 缺乏、大量消耗線粒體 DNA 同埋明顯破裂嘅線粒體網絡嘅末端退化 PN ，呢個進一步強調呢種形式嘅神經退化甚至可以喺細胞死亡之前嘅疾病進行階段恢復。
為咗可視化 Mfn2敲除 PN 中嘅線粒體，我哋用咗一種允許 Cre 依賴線粒體針對黃色螢光蛋白（ YFP ）（ mtYFP ）（20） Cre 嘅小鼠株，並檢查咗體內嘅線粒體形態。我哋發現 PN 中 Mfn2基因嘅破壞會導致線粒體網絡逐漸分裂（圖 S1A ），而最早嘅變化係喺3星期大嘅時候發現。相反 , PN 細胞層嘅實質退化，由 Calbindin 免疫染色嘅損失證明，係喺12週齡先開始（圖1， A 同 B ）。線粒體形態最早嘅變化同神經元死亡嘅可見開始之間嘅時間不匹配，促使我哋研究細胞死亡前線粒體功能障礙所引發嘅代謝變化。我哋開發咗一個基於螢光激活細胞分選（ FACS ）嘅策略，用嚟分離 YFP （ YFP + ）表達嘅 PN （圖1C ），同埋喺對照小鼠（ Mfn2 + / loxP ：： mtYFP loxP-停止 -loxP ：： L7-cre ），以下簡稱 CTRL （圖 S1B ）。根據 YFP 信號嘅相對強度優化閘控策略，令我哋可以將非 PN （ YFPneg ）（圖 S1B ）或者推定嘅螢光軸突/樹突片段（ YFPlow ；圖 S1D ，左）純化 PN 嘅 YFP + 體（ YFPhigh ），呢個係由共焦顯微鏡證實嘅（圖 S1D ，右）。為咗驗證分類群體嘅身份，我哋進行咗 LFQ 蛋白質組學，然後進行主要成分分析，發現 YFPhigh 同 YFPneg 細胞之間有明顯嘅分離（圖 S1C ）。 YFPhigh 細胞顯示出已知嘅 PNs 標記（即 Calb1、 Pcp2、 Grid2同 Itpr3）嘅淨富集（21，22），但係冇神經元或者其他細胞類型中常見表達嘅蛋白質嘅富集（圖1D ））。喺獨立實驗中收集嘅分類 YFPhigh 細胞樣本之間嘅比較顯示相關係數 > 0.9，證明生物複製之間嘅再現性良好（圖 S1E ）。總括嚟講，呢啲數據驗證咗我哋對可行嘅 PN 嘅急性同特定隔離計劃。由於所用嘅 L7-cre 驅動系統會喺分娩後嘅第一個星期誘導馬賽克重組（23），我哋開始喺 CTRL 同條件性（ Mfn2 loxP / loxP:: mtYFP loxP-stop-loxP:: L7-cre ）中殺死小鼠收集神經元。重組完成之後，喺4星期大嗰陣叫做 Mfn2cKO 。作為終點，我哋選擇咗8星期大，當時雖然有明顯嘅線粒體碎片化，但係 PN 層仍然完整（圖1B 同圖 S1A ）。總括嚟講，我哋總共量化咗3013種蛋白質，當中大約22 % 係基於 MitoCarta 2.0注釋，基於線粒體蛋白質組作為線粒體（圖1E）（圖1E）（24）。喺第8週進行嘅差異基因表達分析顯示，只有10.5 % 嘅所有蛋白質有顯著嘅變化（圖1F 同圖 S1F ），其中195種蛋白質係下調，120種蛋白質係上調（圖1F ）。值得注意嘅係，呢個數據集嘅「創新途徑分析」顯示，差異表達嘅基因主要屬於一組受限制嘅特定代謝途徑（圖1G ）。有趣嘅係，雖然同 OXPHOS 同鈣信號傳導相關嘅途徑嘅下調證實咗融合缺乏嘅 PN 會誘導線粒體功能障礙，但係其他主要涉及氨基酸代謝嘅類別都顯著上調，呢個同線粒體 PN 中發生嘅代謝重新接線係一致嘅。功能障礙。
(A) CTRL 同 Mfn2cKO 小鼠嘅小腦切片嘅代表性共焦相片，顯示 PN 逐漸損失（鈣蛋白，灰色）；核用 DAPI 對染。 （ B ）（ A ）嘅量化（單向方差分析， * * * P < 0.001； n = 3隻小鼠嘅4至6個圓圈）。 (C) 實驗工作流程。 (D) 普金耶氏特異標記嘅熱圖分佈（上）同其他細胞類型（中）。 (E) 韋恩圖，顯示喺分類嘅 PN 中鑑定出嚟嘅線粒體蛋白質數量。 （ F ）8週時 Mfn2cKO 神經元中差異表達蛋白質嘅火山圖（顯著性截止值為1.3）。 （ G ）創意途徑分析顯示咗 Mfn2cKO PN 中五個最重要嘅上調（紅色）同下調（藍色）途徑，分類為8星期。顯示咗每種檢測到嘅蛋白質嘅平均表達水平。灰度熱圖：調整咗嘅 P 值。 ns ，唔重要。
蛋白質組學數據顯示，複合物 I 、 III 同 IV 嘅蛋白質表達逐漸下降。複合體 I 、 III 同 IV 都含有必要嘅 mtDNA 編碼亞基，而複合體 II ，只係核編碼，基本上唔受影響（圖2A 同圖 S2A ）。 。同蛋白質組學結果一致，小腦組織切片嘅免疫組織化學顯示， PN 中複合體 IV 嘅 MTCO1（線粒體細胞色素 C 氧化酶亞基1）亞基水平逐漸下降（圖2B ）。 mtDNA 編碼嘅亞基 Mtatp8顯著降低（圖 S2A ），而核編碼嘅 ATP 合成酶亞基嘅穩定狀態水平保持不變，呢個係同當 mtDNA 表達穩定嗰陣已知嘅穩定 ATP 合成酶亞組裝 F1複合體一致。呢個形成係一致嘅。中斷（7）。透過實時聚合酶連鎖反應（ qPCR ）評估分選嘅 Mfn2cKO PN 中嘅 mtDNA 水平，證實咗 mtDNA 拷貝數逐漸下降。同對照組相比，喺8星期大嘅時候，只係保留咗大約20 % 嘅 mtDNA 水平（圖2C ）。同呢啲結果一致，用咗 Mfn2cKO PNs 嘅共焦顯微鏡染色嚟檢測 DNA ，顯示線粒體核苷酸嘅時間依賴性消耗（圖2D ）。我哋發現只有部分參與線粒體蛋白質降解同壓力反應嘅候選物會上調，包括 Lonp1、 Afg3l2同 Clpx ，同埋 OXPHOS 複合體組裝因子。檢測到參與凋亡嘅蛋白質水平冇顯著變化（圖 S2B ）。同樣地，我哋發現參與鈣運輸嘅線粒體同內質網通道只係有輕微嘅變化（圖 S2C ）。此外，對自噬相關蛋白質嘅評估發現冇顯著變化，呢個同免疫組織化學同電子顯微鏡喺體內觀察到嘅自噬體嘅可見誘導一致（圖 S3）。然而， PNs 嘅進行性 OXPHOS 功能障礙伴隨住明顯嘅超微結構線粒體變化。喺5同8週齡嘅 Mfn2cKO PNs 嘅細胞體同樹突樹中可以見到線粒體群，而內膜結構亦發生咗深刻嘅變化（圖 S4、 A 同 B ）。同呢啲超微結構變化同 mtDNA 嘅顯著下降一致，用四甲基羅丹明甲酯（ TMRM ）分析急性腦小腦切片，發現 Mfn2cKO PNs 嘅線粒體膜電位顯著降低（圖 S4C ）。
（ A ） OXPHOS 複合物嘅表達水平嘅時間過程分析。只考慮8星期嗰陣 P <0.05嘅蛋白質（雙向方差分析）。虛線：同 CTRL 相比冇調整。 （ B ）左：用抗 MTCO1抗體標記嘅小腦切片嘅例子（比例尺，20 μ m ）。普金耶細胞體所佔有嘅區域係被黃色覆蓋。右： MTCO1水平嘅定量（單向方差分析； n = 7至20個細胞，係嚟自三隻小鼠）。 （ C ）對排序後嘅 PN 中 mtDNA 拷貝數嘅 qPCR 分析（單向方差分析； n = 3至7隻小鼠）。 (D) 咗：用抗 DNA 抗體標記嘅小腦切片嘅例子（比例尺，20 μ m ）。普金耶細胞體所佔有嘅區域係被黃色覆蓋。右： mtDNA 病變嘅定量（單向方差分析； n = 三隻小鼠嘅5至9個細胞）。 （ E ）一個急性小腦切片嘅例子，顯示全細胞貼片夾記錄中嘅 mitoYFP + Purkinje 細胞（箭頭）。 (F) IV 曲線嘅量化。 (G) CTRL 同 Mfn2cKO 普金耶細胞嘅去極電流注入嘅代表性記錄。頂部痕跡：觸發 AP 嘅第一個脈衝。底部軌跡：最大 AP 頻率。 (H) 突觸後自發輸入（ sPSP ）嘅量化。代表性嘅錄影軌跡同埋佢嘅縮放比例喺（ I ）入面顯示。單向方差分析分析咗三隻小鼠嘅 n = 5至20個細胞。數據以平均值 ± SEM 表示； * P < 0.05； * * P < 0.01； *** P < 0.001。 (J) 使用穿孔貼片夾模式記錄嘅自發性 AP 嘅代表性痕跡。頂部軌跡：最大 AP 頻率。底部痕跡：放大單一 AP 。 (K) 根據（ J ）量化平均同最大 AP 頻率。曼惠特尼測試；分析咗四隻小鼠嘅 n = 5個細胞。數據以平均值 ± SEM 表示；唔重要。
喺8星期大嘅 Mfn2cKO PN 中檢測到明顯嘅 OXPHOS 損傷，表明神經元嘅生理功能係嚴重異常。因此，我哋透過喺急性小腦切片中進行全細胞貼片夾記錄，分析咗 OXPHOS 缺乏神經元喺4至5週同7至8週嘅被動電特性（圖2E ）。估唔到，雖然細胞之間有細微嘅差異，但係 Mfn2cKO 神經元嘅平均靜止膜電位同輸入電阻同對照組相似（表1）。同樣地，喺4至5星期大嗰陣，電流電壓關係（ IV 曲線）亦都冇發現顯著變化（圖2F ）。然而，冇7至8星期大嘅 Mfn2cKO 神經元喺 IV 方案（超極化步驟）中存活，表明喺呢個後期對超極化電位有明顯嘅敏感性。相反，喺 Mfn2cKO 神經元中，引起重複動作電位（ AP ）放電嘅去極化電流係可以好好耐受嘅，表明佢哋嘅整體放電模式同8星期大嘅對照神經元冇顯著差異（表1同圖2G ）。同樣地，自發性突觸後電流（ sPSCs ）嘅頻率同振幅同對照組相似，而事件頻率由4星期增加到5星期，增加到7星期至8星期，亦都係有類似嘅增加（圖2、 H 同 I ）。 PNs 嘅突觸成熟期（25）。穿孔 PNs 貼片後亦得到類似結果。呢個配置可以防止細胞 ATP 缺陷嘅可能補償，就好似全細胞膜片夾記錄中可能發生嘅情況噉。特別係， Mfn2cKO 神經元嘅靜止膜電位同自發發射頻率並冇受到影響（圖2、 J 同 K ）。總結嚟講，呢啲結果表明有明顯 OXPHOS 功能障礙嘅 PN 可以好好噉應付高頻放電模式，表明有一個補償機制令佢哋可以維持接近正常嘅電生理反應。
數據以平均值 ± SEM 表示（單向方差分析，霍爾姆 - 西達克多重比較檢驗； * P < 0.05）。單位號碼用括號表示。
我哋出發去調查蛋白質組學數據集入面有冇任何類別（圖1G ）包括可以抵消嚴重 OXPHOS 缺乏嘅途徑，從而解釋點解受影響嘅 PN 可以維持接近正常嘅電生理（圖2， E 至 K ）。 。蛋白質組學分析顯示，參與支鏈氨基酸（ BCAA ）分解代謝嘅酶明顯上調（圖3A 同圖 S5A ），而最終產物乙酰輔酶 A （ CoA ）或者琥珀酰輔酶 A 可以補充動脈硬化中嘅三羧酸（ TCA ）循環。我哋發現 BCAA 轉氨酶1（ BCAT1）同 BCAT2嘅含量都增加咗。佢哋透過由 α- 酮谷氨酸生成谷氨酸，催化 BCAA 分解代謝嘅第一步（26）。所有構成支鏈酮酸脫氫酶（ BCKD ）複合物嘅亞基都會上調（呢個複合物會催化所得嘅 BCAA 碳骨架隨後嘅不可逆脫羧）（圖3A 同圖 S5A ）。但係，喺分類嘅 PN 入面，冇發現 BCAA 本身有明顯嘅變化，可能係因為細胞對呢啲必需氨基酸嘅攝取增加，或者係因為用咗其他來源（葡萄糖或者乳酸）嚟補充 TCA 循環（圖 S5B ）。缺乏 OXPHOS 嘅 PN 喺8星期大亦都顯示出谷氨酰胺分解同轉氨活性增加，呢個可以由線粒體酶谷氨酰胺酶（ GLS ）同谷氨酰胺丙酮酸轉氨酶2（ GPT2）嘅上調反映出嚟（圖3、 A 同 C ）。值得注意嘅係， GLS 嘅上調只限於剪接同型谷氨酰胺酶 C （ GLS-GAC ）（ Mfn2cKO / CTRL 嘅變化大約係4.5倍， P = 0.05），而佢喺癌組織中嘅特異上調可以支援線粒體生物能量。 （27）。
(A) 熱圖顯示咗8星期嗰陣指定途徑嘅蛋白質水平嘅倍數變化。 (B) 用抗 PCx 抗體標記嘅小腦切片嘅例子（比例尺，20 μ m ）。黃色箭頭指向浦肯野細胞體。 （ C ）時間過程蛋白質表達分析被識別為動脈粥樣硬化嘅重要候選物（多重 t 檢驗， * FDR <5 % ； n = 3-5隻小鼠）。 (D) 上圖：示意圖，顯示咗進入 [1-13C] 丙酮酸示蹤劑中所含嘅標記碳嘅唔同方式（即係透過 PDH 或跨動脈途徑）。底部：小提琴圖表顯示用［1-13C ］丙酮酸標記急性小腦片後，單標記碳（ M1）轉化為天冬氨酸、檸檬酸同蘋果酸嘅百分比（配對 t 檢驗； ** P < 0.01）。 (E) 對指定路徑進行綜合時間史分析。只考慮8星期嗰陣 P <0.05嘅蛋白質。虛線：冇調整值（雙向方差分析； * P < 0.05； * * * P < 0.001）。數據以平均值 ± SEM 表示。
喺我哋嘅分析中， BCAA 分解代謝已經成為其中一個關鍵嘅上調途徑。呢個事實強烈表明，喺缺乏 OXPHOS 嘅 PN 中，進入 TCA 週期嘅通氣量可能會改變。呢個可能代表神經元代謝重新連接嘅一種主要形式，喺維持嚴重嘅 OXPHOS 功能障礙期間，呢個可能會對神經元生理同生存有直接影響。同呢個假設一致，我哋發現主要嘅抗動脈粥樣硬化酶 PCx 係上調嘅（ Mfn2cKO / CTRL 大約變化1.5倍；圖3A ），催化丙酮酸轉化為草酸乙酸（28），相信呢種酶喺腦組織中嘅表達只限於星形膠質細胞302。同蛋白質組學結果一致，共焦顯微鏡顯示 PCx 表達喺 OXPHOS 缺乏嘅 PN 中特異同顯著增加，而 PCx 反應性主要限於對照組嘅鄰近伯格曼膠質細胞（圖3B ）。為咗功能性測試觀察到嘅 PCx 上調，我哋用 [1-13C] 丙酮酸示蹤劑處理急性小腦切片。當丙酮酸被丙酮酸脫氫酶（ PDH ）氧化時，佢嘅同位素標籤消失，但係當丙酮酸透過血管反應代謝嗰陣，就會被納入 TCA 循環中間體（圖3D ）。為咗支持我哋嘅蛋白質組學數據，我哋喺 Mfn2cKO 切片嘅天冬氨酸中觀察到呢個示蹤劑嘅大量標記，而檸檬酸同蘋果酸亦都有中度嘅趨勢，雖然唔顯著（圖3D ）。
喺多巴胺神經元特異破壞線粒體轉寫因子 A 基因（ Tfam ）引起嘅線粒體功能障礙嘅 MitoPark 小鼠嘅多巴胺神經元中（圖 S6B ）， PCx 表達亦都顯著上調（31），表明丙酮酸動脈硬化嘅疾病嘅發生係喺神經元體 OXPHOS 嘅功能障礙期間受到調節。值得注意嘅係，已經發現咗可能喺可能同動脈硬化有關嘅神經元中表達嘅獨特酶（32-34）會喺缺乏 OXPHOS 嘅 PN 中顯著上調，例如丙酰輔酶 A 羧化酶（ PCC-A ）、丙酰輔酶 A 將丙酰輔酶 A 轉化為丙酰輔酶 A 同其主要作用嘅蘋果酰亞胺酸酶（ ME ）係從蘋果酸中回收丙酮酸（圖3， A 同 C ）（33，35）。另外，我哋發現 Pdk3酶有顯著增加，呢個酶會磷酸化 PDH ，從而失活（36），而激活 PDH 嘅 Pdp1酶或者 PDH 酶複合體本身就冇檢測到任何變化（圖3A ）。一貫地，喺 Mern2cKO PNs 中， Ser293中 PDH 複合物嘅丙酮酸脫氫酶 E1成分（已知可以抑制 PDH 嘅酶活性）嘅 α1亞基 α （ PDHE1 α ）亞基嘅磷酸化增強（圖 S6C ）（圖 S6C ）。丙酮酸冇血管通道。
最後，根據報告，我哋發現絲氨酸同甘氨酸生物合成嘅超級途徑、相關嘅線粒體葉酸（1C）循環同脯氨酸生物合成（圖1G 同圖 S5C ）都係喺活化過程中顯著上調。周圍嘅組織會因為線粒體功能障礙而被激活（5-7）。支持呢啲蛋白質組學數據嘅共焦分析顯示，喺缺少 OXPHOS 嘅 PN 中，8星期大嘅小鼠嘅小腦切片接受咗絲氨酸羥甲基轉移酶2（ SHMT2），呢個係線粒體葉酸循環嘅關鍵酶。顯著嘅免疫反應（圖 S5D ）。喺13個 CU- 葡萄糖孵育嘅急性小腦切片中，代謝追蹤實驗進一步證實咗丁二酸同脯氨酸生物合成嘅上調，表明碳同型向丁二酸同脯氨酸嘅通量增加（圖 S5E ）。由於 GLS 同 GPT2促進嘅反應係負責由谷氨酸合成谷氨酸，同埋谷氨酸同 α- 酮谷氨酸之間嘅轉氨基，所以佢哋嘅上調表明 OXPHOS 缺乏嘅神經元對谷氨酸嘅需求增加，呢個可能係為咗維持膠原蛋白嘅增加生物合成（圖 S5C ）。同呢啲變化相反，對 PN 特異性 Mfn2cKO 小鼠嘅小腦星形膠質細胞進行嘅蛋白質組學分析顯示，呢啲途徑（包括所有抗過氧化物酶）喺表達上冇顯著變化，因此證明呢種代謝重新定向對降解嘅 PN 有選擇性（圖 S6，啲至 G ）。
總結嚟講，呢啲分析顯示咗 PN 中特定代謝途徑嘅時間激活模式有顯著唔同嘅模式。雖然神經元線粒體功能異常可以導致早期動脈硬化同 1C 重塑（圖3E 同圖 S5C ），甚至係 I 同 IV 複合物嘅表達有可預測嘅變化，但係絲氨酸從頭合成嘅變化只係喺後期先明顯。 OXPHOS 功能障礙（圖3E 同圖 S5C ）。呢啲發現定義咗一個順序過程，即係壓力誘導嘅線粒體（1C 循環）同細胞質（丁酸生物合成）反應同 TCA 循環嘅動脈粥樣硬化嘅增加協同作用，重塑神經元代謝。
8 星期大嘅 OXPHOS 缺乏型 PN 可以維持高頻刺激活動，並且經歷顯著嘅代謝重新連接，以補償線粒體功能障礙。呢個發現提出咗一個有趣嘅可能性，即使喺呢一刻，呢啲細胞亦都可能會接受治療干預，以延遲或者預防神經退行性變。遲。我哋透過兩個獨立嘅干預措施解決咗呢個可能性。喺第一個方法入面，我哋設計咗一個 Cre 依賴性腺相關病毒（ AAV ）輸送體，令到 MFN2可以喺體內嘅 OXPHOS 缺乏 PN 中選擇性表達（圖 S7A ）。編碼 MFN2嘅 AAV 同螢光報告基因 mCherry （ Mfn2-AAV ）喺體外嘅原代神經元培養中得到驗證，令到 MFN2以 Cre 依賴嘅方式表達，並且拯救咗線粒體形態，從而防止 Mfn2cKO 神經元嘅神經突變（圖 S7、 B 、啲同 E ）。接下來，我哋進行咗體內實驗，將8星期大嘅 Mfn2-AAV 立體噉運送到 Mfn2cKO 同對照小鼠嘅小腦皮質，並分析咗12星期大嘅小鼠（圖4A ）。接受治療嘅 Mfn2cKO 小鼠死亡（圖1， A 同 B ）（16）。體內病毒轉導導致部分小腦圈選擇性表達 PN （圖 S7、 G 同 H ）。注射只表達 mCherry 嘅對照 AAV （ Ctrl-AAV ）對 Mfn2cKO 動物嘅神經退行性程度冇顯著影響。相反，用 Mfn2-AAV 轉導嘅 Mfn2cKOs 嘅分析顯示出 PN 細胞層有顯著嘅保護作用（圖4、 B 同 C ）。特別係，神經元密度似乎同對照動物幾乎分唔開（圖4、 B 同 C ，同埋圖 S7、 H 同 I ）。表達 MFN1而唔係 MFN2喺拯救神經元死亡方面同樣有效（圖4C 同圖 S7、 C 同 F ），表明宮外 MFN1嘅表達可以有效補充 MFN2嘅缺乏。喺單一 PN 水平進一步分析顯示， Mfn2-AAV 大大拯救咗線粒體嘅超聲波結構，將 mtDNA 水平正常化，並且逆轉咗抗血管生成標記 PCx 嘅高表達（圖4， C 至 E ）。喺休息狀態下，目視檢查救出嚟嘅 Mfn2cKO 小鼠，發現佢哋嘅姿勢同運動症狀（動作 S1至 S3）有所改善。結論係，呢啲實驗顯示，將 MFN2延遲重新引入到嚴重缺乏 OXPHOS 嘅 PN 中，足以逆轉 mtDNA 嘅消耗同誘導動脈粥樣硬化，從而防止體內軸突退化同神經元死亡。
(A) 一個方案，顯示咗當指定嘅代謝途徑被激活嗰陣注射編碼 MFN2嘅 AAV 嘅實驗時間表。 (B) 喺 Mfn2cKO 小鼠 8 星期轉導，並用抗 Calbindin 抗體標記嘅 12 週齡小腦切片嘅代表性共焦圖像。右：軸突纖維嘅縮放。軸突變焦嘅比例係450同75 μ m 。 （ C ）左： AAV 轉導環（ AAV + ）中嘅普金耶細胞密度嘅定量（單向方差分析； n = 3隻小鼠）。右：第12週轉導 PN 嘅 mtDNA 焦點分析（未配對 t 檢驗； n = 6 隻來自三隻小鼠嘅細胞）。 * P < 0.05； ** P < 0.01。 (D) 用指定病毒輸送體轉導嘅 Mfn2cKO 小腦切片嘅 PN 嘅代表性透過電子顯微鏡圖。粉紅色嘅面具係顯示樹突所佔有嘅區域，而黃色嘅虛線方塊係顯示右邊提供嘅變焦； n 代表核。刻度棒，1 μ m 。 （ E ）顯示咗一個喺12週轉導嘅 PN 中 PCx 染色嘅例子。刻度棒，20 μ m 。 OE ，過度表達； FC, 摺變。
最後，我哋研究咗過氧化物酶誘導嘅細胞存活喺經歷過 OXPHOS 功能障礙嘅 PN 中嘅重要性。我哋生成咗編碼 AAV-shRNA （短髮夾 RNA ）嘅 mCherry ，特別針對小鼠 PCx mRNA （ AAV-shPCx ），並將病毒或者佢嘅攪拌對照（ AAV-scr ）注射入 Mfn2cKO 小鼠嘅小腦。注射係喺第四週齡進行（圖5A ），以便喺 PCx 表達增加（圖3C ）同 PN 細胞層仍然完整（圖1A ）嘅期間達到有效嘅 PCx 敲低。值得注意嘅係，敲低 PCx （圖 S8A ）會導致 PN 死亡嘅顯著加速，而呢個速度只限於受感染嘅環（圖5、 B 同 C ）。為咗理解 PCx 上調誘導嘅代謝效應嘅機制，我哋研究咗 PCx 敲低同 AAV 介導嘅光學生物感應器 Grx1-roGFP2同時表達後 PN 嘅氧化還原狀態（圖 S8， B 至啲），以評估谷胱甘肽氧化還原電位嘅相對變化（38）。然後，我哋喺7星期大嘅 Mfn2cKO 或對照同群嘅急性腦切片上進行兩光子螢光終身成像顯微鏡（ FLIM ），喺驗證 FLIM 條件之後檢測細胞質氧化還原狀態嘅潛在變化（圖 S8， E 至 G ）。分析顯示，單一缺乏 PCx 表達嘅 Mfn2cKO PN 嘅氧化狀態有顯著增加，呢個同對照神經元或者只表達攪拌 shRNA 嘅 Mfn2cKO PN 唔同（圖5、啲同 E ）。當 PCx 表达下調時，顯示高度氧化狀態嘅 Mfn2cKO PNs 百分比增加超過三倍（圖5E ），表明 PCx 上調維持咗退化神經元嘅氧化還原能力。
（ A ）一個方案，顯示咗當指定嘅代謝途徑被激活嗰陣注射編碼 shPCx 嘅 AAV 嘅實驗時間表。 (B) 喺4星期轉導同用抗鈣蛋白抗體標記嘅 Mfn2cKO 小鼠嘅8星期大小腦切片嘅代表性共焦相片。比例尺，450 μ m 。 (C) AAV 轉導環中普金耶細胞密度嘅定量（單向方差分析； n = 3至4隻小鼠）。數據以平均值 ± SEM 表示； *** P < 0.001。 (D) 代表性嘅 FLIM 圖顯示咗喺指定實驗條件下，7星期大嘅 PN 表達谷胱甘肽氧化還原感應器 Grx1-roGFP2嘅平均壽命。 LUT （查詢表）比例：生存時間間隔（以皮秒計）。比例尺，25 μ m 。 （ E ）直方圖顯示咗（ D ）嘅 Grx1-roGFP2壽命值分佈（每個條件下兩隻小鼠嘅 n = 158至368個細胞）。每個直方圖上面嘅餅乾圖：顯示壽命值明顯長（紅色，氧化）或短（藍色，縮短）嘅細胞數量，超過 CTRL-AAV-scr 嘅平均壽命值嘅1個 SD 。 (F) 提出嘅模型顯示神經元 PCx 上調嘅保護作用。
總括嚟講，我哋喺呢度提供嘅數據顯示， MFN2嘅重新表達可以完全拯救嚴重嘅 OXPHOS 缺乏、嚴重嘅 mtDNA 耗盡同埋極度異常嘅 ista 形態嘅晚期 PN ，從而即使係晚期疾病都可以提供持續嘅進展。神經退化提供細胞死亡前階段嘅可逆證據。呢種代謝靈活性嘅程度更加係由神經元誘導動脈粥樣硬化（ TCA 循環嘅重新連接）嘅能力所強調，呢個能力會抑制缺乏 OXPHOS 嘅 PN 中嘅 PCx 表達，並且增強細胞死亡，從而發揮保護作用（圖5F ）。
喺呢項研究中，我哋提供咗證據，證明 PN 對 OXPHOS 功能障礙嘅反應係透過代謝程式激活嘅差異激活途徑逐漸收斂到 TCA 循環動脈粥樣硬化。我哋用好多互補嘅方法證實咗蛋白質組分析，並且發現當受到嚴重線粒體功能障礙嘅挑戰時，神經元會有一種以前未知嘅代謝彈性形式。令我哋驚訝嘅係，整個重新接線過程未必標誌住伴隨神經退行逐漸而不可逆嘅終極代謝狀態，但我哋嘅數據表明，即使喺細胞死亡之前嘅階段，佢都可能構成一個維持神經元嘅功能補償機制。呢個發現表明神經元喺身體入面有相當程度嘅代謝可塑性。呢個事實證明咗後來重新引入 MFN2可以逆轉關鍵代謝標記嘅表達，並防止 PN 退化。相反，佢會抑制動脈硬化，加速神經。變性人。
我哋研究中其中一個最引人入勝嘅發現係，缺乏 OXPHOS 嘅 PN 可以透過上調特別刺激動脈硬化嘅酶嚟修飾 TCA 循環代謝。代謝重排係癌細胞嘅一個共同特徵，其中有啲細胞依賴谷氨酰胺嚟補充 TCA 循環中間體，以產生還原等效物，呢啲物質會驅動呼吸鏈，並且維持脂質同核苷酸生物合成前體嘅產生（39，40）。最近嘅一項研究顯示，喺經歷緊 OXPHOS 功能障礙嘅外周組織中，谷氨酰胺/谷氨酸代謝嘅重新連接亦都係一個突出嘅特徵（5，41），其中谷氨酰胺進入 TCA 循環嘅方向取決於 OXPHOS 損傷嘅嚴重性（41）。 ）。然而，缺乏明確嘅證據顯示身體中神經元代謝可塑性嘅任何相似性，同埋佢同疾病背景嘅可能相關性。最近嘅體外研究顯示，原發性皮質神經元可以調動谷氨酸池進行神經傳遞，從而喺代謝壓力條件下促進氧化代謝同動脈粥樣硬化（42）。值得注意嘅係，喺 TCA 循環酶琥珀酸脫氫酶嘅藥理抑制下，丙酮酸羧化相信可以維持培養嘅小腦顆粒神經元中草酰乙酸嘅合成（34）。然而，呢啲機制同腦組織（相信動脈粥樣硬化主要局限於星形膠質細胞）嘅生理關係仍然有重要嘅生理意義（43）。喺呢個情況下，我哋嘅數據顯示，體內受 OXPHOS 損傷嘅 PN 可以轉用 BCAA 降解同丙酮酸羧化，呢兩個係 TCA 池中間體嘅兩個主要補充來源。雖然有人提出咗 BCAA 分解代謝對神經元能量代謝嘅推定貢獻，但除咗谷氨酸同 GABA 對神經傳遞嘅作用（44）之外，仍然冇證據顯示呢啲機制係體內。因此，好容易推測功能障礙嘅 PN 可以透過增加動脈硬化，自動補償由同化過程驅動嘅 TCA 中間體嘅消耗。特別係，可能需要上調 PCx 嚟維持對天冬氨酸嘅增加需求，呢個係線粒體功能障礙嘅增殖細胞所提出嘅（45）。然而，我哋嘅代謝組學分析並冇顯示出 Mfn2cKO PNs 嘅天冬氨酸穩定水平有任何顯著變化（圖 S6A ），呢個大概反映咗增殖細胞同有絲分裂後神經元之間天冬氨酸嘅唔同代謝利用率。雖然體內功能障礙神經元中 PCx 上調嘅確切機制仍然有待表徵，但我哋證明咗呢個早期反應喺維持神經元嘅氧化還原狀態方面發揮重要作用，呢個係喺小腦切片上嘅 FLIM 實驗中得到證明。特別係，阻止 PNs 上調 PCx 可以導致更加氧化嘅狀態同埋加速細胞死亡。 BCAA 降解嘅活化同丙酮酸嘅羧化唔係表徵線粒體功能障礙嘅外圍組織嘅方法（7）。所以，佢哋似乎係 OXPHOS 缺乏神經元嘅優先特徵，就算唔係唯一特徵，呢個對神經退行性嚟講係好重要。 。
小腦疾病係一種異質性嘅神經退行性疾病，通常會以運動失調嘅形式出現，而且經常會損害 PN （ 46 ）。呢個神經元群體特別容易受到線粒體功能障礙嘅影響，因為佢哋喺小鼠身上嘅選擇性退化足以再現好多人類脊髓小腦運動失調嘅特徵運動症狀（16，47，48）。根據報告，一個帶有突變基因嘅轉基因小鼠模型同人類脊髓小腦運動失調有關，並且有線粒體功能障礙（49，50），強調研究 PNPH 缺乏 OXPHOS 嘅後果嘅重要性。所以，有效隔離同研究呢個獨特嘅神經元群體係特別適合嘅。但係，鑑於 PN 對壓力非常敏感，而且佔整個小腦細胞群體嘅比例好低，對於好多基於奧米克嘅研究嚟講，將佢哋選擇性分離成全細胞仍然係一個具有挑戰性嘅方面。雖然幾乎係唔可能達到其他細胞類型（特別係成年組織）嘅絕對冇污染，但我哋將有效嘅解離步驟同 FACS 結合，以獲得足夠數量嘅活神經元嚟進行下游蛋白質組學分析，同埋同整個小腦嘅現有數據集相比，蛋白質覆蓋率相當高（大約3000個蛋白質）（51）。透過保留全細胞嘅生存能力，我哋喺呢度提供嘅方法令我哋唔單止可以檢查線粒體代謝途徑嘅變化，仲可以檢查佢嘅細胞質對應物嘅變化，呢個係補充使用線粒體膜標籤嚟富集細胞型複雜組織中線粒體數量嘅新方法（52，53）。我哋所描述嘅方法唔單止同研究 Purkinje 細胞有關，亦可以輕鬆咁應用喺任何類型嘅細胞，以解決病腦嘅代謝變化，包括其他線粒體功能障礙模型。
最後，我哋喺呢個代謝重排過程中找到咗一個治療窗口，可以完全逆轉細胞壓力嘅關鍵跡象，同埋預防神經元退化。因此，理解呢度所描述嘅重新接線嘅功能意義可能會為線粒體功能障礙期間維持神經元生存能力嘅可能治療提供基本嘅見解。未來需要進行旨在解剖其他腦細胞類型能量代謝變化嘅研究，以便完全揭示呢個原理對其他神經疾病嘅適用性。
之前已經描述過 MitoPark 小鼠（31）。之前已經描述過有 loxP 侧邊嘅 Mfn2基因嘅 C57BL/6N 小鼠（18），同埋同 L7-Cre 小鼠交配（23）。然後將所得嘅雙異合子後代同純合子 Mfn2loxP/Mfn2loxP 小鼠交配，以產生 Mfn2嘅普金耶特異基因敲除（ Mfn2loxP/Mfn2loxP ； L7-cre ）。喺一個交配嘅亞集中， Gt （ ROSA26） SorStop- 線粒體 -YFP 等位基因（停止 -mtYFP ）係透過額外嘅交叉引入（20）。所有動物程序都按照歐洲、國家同機構指引進行，並得到德國北萊茵 - 威斯特法蘭州烏姆韋爾特同維布拉赫舒茨嘅 LandesamtfürNatur 批准。動物工作亦都遵循歐洲實驗室動物科學協會聯合會嘅指導。
麻醉咗孕婦嘅宮頸離位之後，分離出小鼠胚胎（ E13）。皮質喺補充咗10 mM Hepes 嘅 Hanks 平衡鹽溶液（ HBSS ）中解剖，並傳遞含有木瓜蛋白酶（20 U / ml ）同半胱氨酸（1 μ g / ml ）嘅 Dulbecco 改良鷹培養基。將組織喺 DMEM 中孵育），然後透過酶消化將佢解離。 Ml) 喺37 °C 20分鐘，然後用10 % 胎牛血清嘅 DMEM 機械磨碎。將細胞播種喺塗有聚賴氨酸嘅玻璃蓋片上，密度係每6厘米培養皿2 × 106，或者密度係0.5 × 105細胞/厘米2，以便進行成像分析。小時後，用含有1 % B27補充劑同0.5 mM GlutaMax 嘅神經基底冇血清培養基取代培養基。然後將神經元喺整個實驗期間保持喺37 °C 同5 % CO2，並且每星期餵食一次。為咗誘導體外重組，喺體外第二日用3 μ l （24孔培養皿）或者0.5 μ l （24孔板）以下 AAV9病毒載體去處理神經元： AAV9. CMV . PI . eGFP 。 WPRE . bGH （加德基因，目錄號105530-AAV9）同 AAV9. CMV . HI . eGFP-Cre . WPRE . SV40（加德基因，目錄號105545-AAV9）。
小鼠 Mfn1同 Mfn2互補 DNA （分別係由 Addgene 質粒 # 23212同 # 23213得到）喺 C 末端用 V5序列（ GKPIPNPLLGLDST ）標記，並且透過 T2A 序列同 mCherry 喺框架中融合。 Grx1-roGFP2係由海德堡 TP 迪克 DFKZ （德國研究技術）送出嘅禮物。透過使用傳統克隆方法取代 td 番茄盒，將盒亞克隆到 pAAV-CAG-FLEX-td 番茄骨幹（加德基因參考編號28306），以生成 pAAV-CAG-FLEX-m 櫻桃 -T2A-MFN2-V5、 pFLEX2-m-CAG-1 pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2輸送体。類似嘅策略係用嚟生成對照輸送體 pAAV-CAG-FLEX-mCherry 。為咗生成 AAV-shPCx 構建體，需要一個質粒 AAV 輸送體（輸送體構建器， pAAV [ shRNA ］ -CMV-mCherry-U6-mPcx- [ shRNA # 1］），呢個輸送體包含編碼針對小鼠 PCx 嘅 shRNA 嘅 DNA 序列（5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTAAGCACC3G 控制）係喺 CMV 啟動子嘅控制下使用。輔助 AAV 輸送體嘅生產係根據製造商嘅指示（細胞生物實驗室）進行。簡而言之，用載有 mCherry-T2A-MFN2-V5（ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5）、 mCherry-T2A-MFN1-V5（ pAAV-CAG-FLEX-mCherry ）嘅轉移質粒瞬時轉染 293VAAV 細胞 N-T2AAV （ pAAV-CAG-FLEX-mCherry ）或 Grx-roGFP2（ pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ）編碼基因，以及編碼 AAV1衣殼蛋白和輔助蛋白包裝質粒質粒，使用磷酸鈣法。粗病毒上清液係透過喺乾冰/乙醇浴中進行凍解凍循環，並將細胞喺磷酸緩衝鹽水（ PBS ）中溶解而得到。透過不連續碘二醇梯度超聲波离心（32，000 rpm同4 °C 24小時）純化 AAV 載體，並使用 Amicon 超15離心過濾器濃縮。基因組滴度嘅 AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5［2.9 ​​× 1013基因組抄本（ GC ）/毫升］、 AAV1-CAG-FLEX-m 櫻桃（6.1 × 1012 GC / 毫升）、 AAV1-CAG-FLEX 嘅基因組滴度係如前文所述（ q-5MF ）定量（1.9 × 1013GC/毫升）同 AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2（8.9 × 1012GC/毫升）。
原發性神經元喺冰冷嘅1x PBS 中刮走，顆粒化，然後喺含有磷酸酶同蛋白酶抑制劑（羅氏）嘅0.5 % Triton X-100 / 0.5 % 脫氧膽酸鈉 / PBS 溶解緩衝液中均質化。蛋白質定量係用二辛可寧酸測定法（熱費雪科學公司）進行。然後用 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然後印迹到聚偏二氟乙烯膜（ GE Healthcare ）上。阻斷非特異性部位，然後用一抗（詳情請睇表 S1）喺 5% 牛奶中孵育（用 Tween 嘅 Tris 緩衝盐水），洗淨步驟同二抗喺 TBST Incubate 中孵育。用一抗喺 +4 °C 溫育過夜。洗淨後，於室溫下應用二次抗體 2 小時。隨後，透過將相同嘅印迹同抗 β - 肌動蛋白抗體溫育，確認咗相同嘅載荷。通過轉換為化學發光和增強化學發光來檢測（ GE Healthcare ）。
將之前播種喺玻璃蓋片上嘅神經元喺室溫下喺指定時間點用4 % 對甲醛（ PFA ）/ PBS 固定10分鐘。將蓋片首先喺室溫下用0.1 % Triton X-100/PBS 滲透5分鐘，然後用阻斷緩衝液［3 % 牛血清白蛋白（ BSA ） / PBS ］滲透。第二天，用阻斷緩衝液洗淨蓋片，並用適當嘅螢光囊結合二次抗體喺室溫下溫育2小時；最後，將樣本用 PBS 徹底洗淨，用 4 ' ，6-二脒基 -2 -苯基吲哚（ DAPI ）對染，然後用 Aqua-Poly/Mount 固定喺顯微鏡片上。
小鼠（雄性同雌性）經腹腔注射氯胺酮（130毫克/公斤）同木唑嗪（10毫克/公斤）麻醉，並皮下施用卡洛芬鎮痛藥（5毫克/公斤），並放入配備暖墊嘅立體定向器械（ Kopf ）中。露出頭骨，用牙鑽將對應 mis 骨嘅小腦皮質部分變薄（由 lambda 開始：尾1.8，側1，對應小葉 IV 同 V ）。用彎曲嘅注射器針小心噉喺頭骨度打個細窿，以免破壞下面嘅血管系統。然後將薄嘅拉玻璃毛細管慢慢插入微孔（由硬膜腹側嘅 -1.3至 -1），並將200至300 nl AAV 用手動注射器（成志）以低壓注射幾次，持續時間10至20分鐘窗口。輸注後，再放置毛細血管10分鐘，等病毒完全擴散。毛細血管抽出之後，皮膚會小心縫合，以最小化傷口炎症，令動物可以康復。啲動物喺手術後用鎮痛藥（卡斯波芬）治療幾日，期間仔細監測佢哋嘅身體狀況，然後喺所述時間點安樂死。所有程序都按照歐洲、國家同機構指引進行，並得到德國北萊茵 - 威斯特法蘭州烏姆韋爾特同維布拉赫舒茨嘅 LandesamtfürNatur 批准。
啲動物用氯胺酮（100毫克/公斤）同木唑嗪（10毫克/公斤）麻醉，然後先用0.1 M PBS 灌注心臟，然後用4% PFA 嘅 PBS 灌注心臟。將組織解剖，並於4 °C 下於4 % PFA/PBS 中固定過夜。用振動刀（勞卡微系統有限公司，奧地利維也納）喺 PBS 入面由固定嘅腦製作矢狀切片（50 μ m 厚）。除非另有規定，否則自由浮動切片嘅染色係按照上述（13）喺室溫同攪拌下進行。總之，首先，將所得切片用0.5 % Triton X-100/PBS 於室溫下透化15分鐘；對於某啲表位（ Pcx 同 Shmt2），方法係喺80 °C （ PH 9）嘅 tris-EDTA 緩衝液中加熱切片25分鐘，而唔係呢個步驟。接下來，將切片用一抗（見表 S1）喺阻斷緩衝液（3 % BSA/PBS ）中喺4 °C 下攪拌過夜。第二天，用阻斷緩衝液洗淨切片，並用適當嘅螢光囊結合二次抗體喺室溫下溫育2小時；最後，將切片用 PBS 徹底洗淨，用 DAPI 對染，然後用 AquaPolymount On 顯微鏡片固定。
我哋用咗一個配備白光激光同405二極體紫外線激光嘅激光掃描共焦顯微鏡（ TCS SP8-X 或者 TCS 數碼光片，勞卡微系統）嚟對樣本進行成像。透過激發螢光囊同埋用混合探測器（ HyDs ）收集信號， LAS-X 軟件就用嚟喺順序模式下收集符合奈奎斯特抽樣嘅堆疊圖像：對於非定量面板，佢係高度動態嘅信號（例如，喺體細胞同樹突中嘅 mtYFP ）用 HyD 喺 BR 模式下檢測正確嘅 PN 數量）。應用0.3至6 ns 嘅閘控嚟減少背景。
實時成像分類細胞。喺含有1 % B27補充劑同0.5 mM GlutaMax 嘅 Neurobasal-A 培養基中分類後，立即將細胞播種喺聚 L-赖氨酸包覆嘅玻璃片上（ μ -Slide8 Well，同處，目錄號80826），然後將佢保持喺37 °C 同5 % CO2，等細胞沉澱1個鐘。實時成像係喺一個配備白色激光、 HyD 、63 × [1.4數值光圈（ NA ）］油物鏡同加熱台嘅勞卡 SP8激光掃描共焦顯微鏡上進行。
將小鼠快速用二氧化碳麻醉並斬首，將腦部迅速從頭骨中取出，並切成200 μ m 厚（用於 13C 標記實驗）或 275 μ m 厚（用於兩個光子實驗）嘅矢狀切片，填充以下材料雪糕（ HM-650 V ，熱費爾科學公司，德國）冰冷，碳飽和（95 % O2同5 % CO2）低 Ca2 + 人工腦脊液（ ACSF ） NaCl ，2.5 mM KCl ，1.25 mM 磷酸鈉緩衝液，25 mM NaHCO3，25 mM 葡萄糖，0.5 mM CaCl2和330毫升3.5毫升3010毫升300100000000000000000000000000000000000000 both m2000000000000 mM毫摩爾）。將所得腦片轉移至含有較高 Ca2 + ACSF （125.0 mM NaCl 、2.5 mM KCl 、1.25 mM 磷酸鈉緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-葡萄糖、1.0 mM CaCl2和 M420 mM 和 M420 mM 氯化鈉和 1.0 mM CaCl2 和 1.0 mM CaCl2 和 M2.70 mM 嘅預孵育室）至320毫摩爾）。
成像過程中，將切片移入專用成像室，並於 32 ° 至 33 °C 恆溫下連續 ACSF 灌注下進行實驗。切片成像係用多光子激光掃描顯微鏡（ TCS SP8 MP-OPO ，勞卡微系統），配備勞卡25倍物鏡（ NA 0.95，水）， Ti ：藍寶石激光（变色龍視覺 II ，相干）。 FLIM 模組（皮科哈普300，皮科量子）。
Grx1-roGFP2嘅 FLIM 。 PN 細胞質氧化還原狀態嘅變化係用箭形腦片嘅兩光子 FLIM 測量，而 Grx1-roGFP2生物感應器針對 PN 。喺 PN 層，採集場係選擇喺切片表面下方大約50至80 μ m ，以確保有一個可行嘅 PN （即係沿樹突缺乏珠狀結構或者神經元形態變化）同埋雙正 roGFP2感應器同編碼 shRNA PCx 或者佢嘅對照序列嘅 AAV （每個都共表達 mCherry ）。用2倍數碼變焦收集單層圖像［激發波長：890納米； 512納米512像素］。檢測：內部 HyD 、異硫氰酸螢光素（ FITC ）濾鏡組］同埋2至3分鐘內嘅圖像平均，用嚟確保收集到足夠嘅光子（總共1000個光子）嚟進行曲線拟合。當將外源性 10 mM H2O2加入灌注 ACSF （以最大化氧化，導致壽命增加），然後加入 2 mM 二硫三醇（將壽命最小化，導致 S用 FLIMfit 5.1.1軟件分析所獲得嘅結果，將整個圖像嘅單一指數衰退曲線擬合到測量到嘅 IRF （儀器响應函數），而 χ2大約係1。為咗計算單一 PN 嘅壽命，手動繪製神經體周圍嘅掩模，並用每個掩模嘅平均壽命進行量化。
線粒體電位分析。急性切片用100 nM TMRM 直接加入灌注嘅 ACSF 溫育30分鐘之後，用兩光子顯微鏡測量 PN 嘅線粒體電位變化。 TMRM 成像係透過喺920 nm 刺激探針，並使用內部 HyD （異硫氰酸四甲基羅丹明：585/40 nm ）嚟收集信號；透過用相同嘅激發波長但係用唔同嘅內部 HyD （ FITC ：525/50）去成像 mtYFP 。用 ImageJ 嘅圖像計算器外掛程式去評估單細胞層面嘅線粒體電位。總之，插入式方程式： signal = min （ mtYFP ， TMRM ）係用嚟識別喺對應通道嘅單疊共焦圖像中顯示索馬里普金耶嘅 TMRM 信號嘅線粒體區域。然後量化所得掩模中嘅像素面積，然後喺 mtYFP 通道嘅相應閾值單疊圖像上進行標準化，以獲得顯示線粒體電位嘅線粒體部分。
圖像係用 Huygens Pro （科學體積成像）軟件解卷積嘅。對於瓷磚嘅掃描圖片，單一瓷磚嘅蒙太奇係用 LAS-X 軟件提供嘅自動縫合算法製作。圖像校正後，使用 ImageJ 和 Adobe Photoshop 進一步處理圖像，並均勻調整亮度和對比度。使用 Adobe Illustrator 進行圖形準備。
mtDNA 焦點分析。喺用抗 DNA 抗體標記嘅小腦切片上，用共焦顯微鏡量化 mtDNA 病變嘅數量。為細胞體同每個細胞嘅核創建每個目標區域，並使用 Multi Measure 插件（ ImageJ 軟件）計算相應嘅區域。將細胞體面積減去核面積，就可以得到細胞質面積。最後，用分析粒子插件（ ImageJ 軟件）自動量化閾值圖像上指示 mtDNA 嘅細胞質 DNA 點，並將所得結果標準化為 CTRL 小鼠嘅 PN 平均值。結果係以每個細胞嘅平均核苷數量表示。
蛋白質表達分析。用 ImageJ 嘅圖像計算器外掛程式，喺單細胞層面評估 PN 嘅蛋白質表達。總之，喺對應通道嘅單層共焦圖像入面，透過方程式： signal = min （ mtYFP ，抗體），就識別到對 Purkina 嘅某種抗體有免疫反應嘅線粒體區域。然後量化所得掩模中嘅像素面積，然後喺 mtYFP 通道嘅相應閾值單疊圖像上進行標準化，以獲得顯示蛋白質嘅線粒體部分。
普金耶細胞密度分析。用 ImageJ 嘅 Cell Counter 外掛程式去評估普金耶密度，方法係將計數嘅普金耶細胞數目除以計數細胞所佔有嘅小腦環長度。
樣本準備同收集。將對照組同 Mfn2cKO 小鼠嘅腦固定喺0.1 M 磷酸鹽緩衝液（ PB ）中嘅2 % PFA / 2.5 % 戊二醛中，然後用纖毛蟲（ Leica Mikrosysteme GmbH ，奧地利維也納）（厚度50至60 μm ）固定喺1 % P15 % te喺室溫下用鐵氰化鈣1個鐘。切片用蒸餾水洗淨3次，然後用含1 % 乙酸鈾酯嘅70 % 乙醇染色20分鐘。然後將切片喺分級酒精中脫水，並嵌入 Durcupan ACM （ Araldite 鑄造樹脂 M ）環氧樹脂（電子顯微鏡科學，目錄號14040）中，喺硅涂層玻璃片之間，最後喺60 °C 嘅焗爐中聚合48小時。選擇小腦皮質區域，並喺勞卡 Ultracut （勞卡 Mikrosysteme GmbH ，奧地利維也納）上切割50 nm 超薄切片，並喺涂有聚苯乙烯膜嘅2 × 1毫米銅狹窄格上挑選。切片用4 % 乙酸鈾酯嘅 H2O 溶液染色 10 分鐘，用 H2O 洗幾次，然後用雷諾德檸檬酸鉛喺 H2O 中洗 10 分鐘，然後用 H2O 洗幾次。顯微鏡照片係用飛利浦 CM100（美國馬薩斯州沃爾森市熱費爾科學公司）使用 TVIPS （ Tietz 視頻同圖像處理系統） TemCam-F416數碼相機（ TVIPS GmbH ，高廷，美國）拍攝。德國）。
對於感染 AAV 嘅小鼠，將個腦分開，然後切成1毫米厚嘅箭狀切片，然後用螢光顯微鏡檢查小腦，嚟識別 AAV 感染嘅環（即係表達 mCherry ）。只係用咗 AAV 注射導致普金耶細胞層（即係幾乎成個層）喺至少兩個連續嘅小腦環中非常高嘅轉導效率嘅實驗。將 AAV 轉導嘅環微解剖，以便喺固定後過夜（4 % PFA 同2.5 % 戊二醛喺0.1 M 可可酸鹽緩衝液中），並進一步處理。對於 EPON 嵌入，固定組織用0.1 M 椰油酸鈉緩衝液（ Applichem ）洗淨，並用2 % OsO4（ os ，科學服務； Caco ）喺0.1 M 椰油酸鈉緩衝液（ Applichem ）中溫育4小時，然後洗淨2小時。用0.1 M 古卡胺緩衝液重複3次。隨後，用上升系列嘅乙醇將每種乙醇溶液喺4 °C 下溫育15分鐘，以脫水組織。將組織轉移到一氧化丙烯，並喺4 °C 嘅 EPON （西格瑪 - 阿爾德里希）中溫育過夜。將組織放入新鮮嘅 EPON ，喺室溫下放置2個鐘，然後喺62 °C 下埋入72個鐘。用超微切片機（ Leica Microsystems ， UC6）同鑽石刀（ Diatom ， Biel ，瑞士）切割70 nm 超薄切片，並用1.5 % 乙酸鈾酯喺37 °C 染色15分鐘，用檸檬酸鉛溶液染色4分鐘。電子顯微鏡係用 JEM-2100 Plus 透過電子顯微鏡（ JEOL ）拍攝，配備咗相機 OneView 4K 16位（ Gatan ）同數碼顯微鏡軟件（ Gatan ）。為咗分析，用5000 × 或10，000 × 數碼變焦攞到電子顯微鏡圖。
線粒體嘅形態學分析。對於所有分析，個別線粒體嘅輪廓都係用 ImageJ 軟件喺數碼圖像中手動概述。分析咗唔同嘅形態參數。線粒體密度係用每個細胞嘅線粒體總面積除以細胞質面積（細胞質面積 = 細胞面積 - 細胞核面積） × 100所得嘅百分比表示。線粒體嘅圓度係用公式［4 π ∙ （面積/周長2）］計算出嚟。分析咗線粒體嘅 ista 形態，並根據佢哋嘅主要形狀分為兩大類別（「管狀」同「水泡」）。
自噬體/溶酶體數量同密度分析。用 ImageJ 軟件喺數碼圖像入面手動勾勒出每個自噬體/溶酶體嘅輪廓。自噬體/溶酶體面積係用每個細胞嘅總自噬體/溶酶體結構面積除以細胞質面積（細胞質面積 = 細胞面積 - 核面積） × 100計算出嚟嘅百分比表示。自噬體/溶酶體嘅密度係將總數除以每個細胞嘅自噬體/溶酶體結構數量（以細胞質面積計）計算出嚟（細胞質面積 = 細胞面積 - 核面積）。
急性切片同樣本準備嘅標籤。對於需要葡萄糖標記嘅實驗，將急性腦切片轉移到預先孵育室，當中含有飽和碳（95 % O2同5 % CO2）、高 Ca2 + ACSF （125.0 mM NaCl 、2.5 mM KCl 、1.25 mM 磷酸鈉緩衝液、25.0 mM 2g-1.010.001001000000000000000000000000000000000000 呎 元mM CaCl 2同2.0 mM MgCl 2，調整到 pH 7.4同310至320 mOsm ），其中葡萄糖係13 C 6-葡萄糖取代（歐里索托普，目錄號 CLM-1396）。對於需要丙酮酸標記嘅實驗，將急性腦切片轉移到較高嘅 Ca2 + ACSF （125.0 mM NaCl 、2.5 mM KCl 、1.25 mM 磷酸鈉緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-葡萄糖、1.0 mM Ca20 m 同加入 M.g 310至320mOsm），並加入1mM 1-［1-13C］丙酮酸（歐里索托普，目錄號 CLM-1082）。將切片喺37 °C 下孵育90分鐘。實驗結束時，用含有75 mM 碳酸銨嘅水溶液（ pH 7.4）快速洗淨切片，然後喺40:40:20（ v ： v ： v ）乙腈（ ACN ）：甲醇：水中均質化。將切片喺冰上溫育30分鐘之後，將樣本以21，000克喺4 °C 下離心10分鐘，然後將清澈嘅上清液喺 SpeedVac 濃縮器中乾燥。所得乾燥代謝物顆粒儲存於 -80 ° C 直至分析。
13 種 C 標記氨基酸嘅液相色譜 - 質譜分析。對於液相色譜 - 質譜（ LC-MS ）分析，將代謝物顆粒重懸浮喺75 μl LC-MS 級水（霍尼韋爾）中。喺4 °C 下以21,000 g 離心5分鐘之後，20 μl 嘅澄清上清液用嚟做氨基酸通量分析，而其餘嘅提取物就即刻用嚟做陰離子分析（見下文）。氨基酸分析係用之前所講嘅苯甲酰氯衍生化方案進行（55，56）。第一步，將10 μ l 100 mM 碳酸鈉（西格瑪 - 阿爾德里希）加入20 μ l 代謝物提取物中，然後將10 μ l 2 % 苯甲酰氯（西格瑪 - 阿爾德里希）加入到 LC 級 ACN 中。將樣本短暫漩渦，然後喺20 °C 下以21,000 g 離心5分鐘。將清除嘅上清液轉移到一個帶有錐形玻璃插入物（200 μl 體積）嘅2毫升自動取樣器小瓶中。樣本係用連接咗 Q-Exactive （ QE ） - HF （超高場軌道捕捉器）高分辨率精密質譜計（熱費爾科學）嘅 Acquity iClass 超高性能液晶系統（ Waters ）進行分析。為咗分析，將2μl嘅衍生化樣本注入含有1.8μm顆粒嘅100 × 1.0毫米高強度二氧化矽 T3柱（水）。流速係100 μ l / min ，緩衝系統由緩衝液 A （10 mM 甲酸銨同0.15 % 甲酸喺水中）同緩衝液 B （ ACN ）組成。梯度係噉嘅：0分鐘時0 % B ； 0 % B 。 0 至 15 % B 喺0至0.1分鐘； 15至17 % B 係0.1至0.5分鐘； B 喺17至55 % ，喺0.5至14分鐘；喺14至14.5分鐘嗰陣， B 喺55至70 % ；喺18分鐘時，14.5至70至100 % B ； 18 至 19 分鐘時 100 % B ； 19 至 19.1 分鐘時為 100 至 0 % B ； 0 % B 喺19.1至28分鐘（55、56）。 QE-HF 質譜計以正電離模式運作，質量範圍為 m / z （質量/電荷比）為50至750。施加嘅分辨率係60，000，而得到嘅增益控制（ AGC ）離子目標係3 × 106，而最大離子時間係100毫秒。加熱電噴電離（ ESI ）源喺3.5 kV 嘅噴霧電壓、250 ° C 嘅毛細管溫度、60 AU （任意單位）嘅鞘氣流同20 AU 嘅輔助氣流下運作。 250 ° C 。 S 鏡頭設定為60 AU 。
陰離子色譜 -MS 分析13C 標記嘅有機酸。剩餘嘅代謝物沉澱物（55 μ l ）係用連接咗 QE-HF 質譜計（熱費爾科學）嘅 Dionex 離子色譜系統（ ICS 5000 + ，熱費爾科學）分析。總之，將5μl嘅代謝物提取物注入配備 HPLC （2 mm × 250 mm，粒徑 4 μ m ，熱費爾科學）嘅 Dionex IonPac AS11-HC 柱，以推入部分環模式，填充比係1。柱溫度保持喺30 ° C ，而自動取樣器設定為6 ° C 。使用配備脫离子水嘅氫氧化鈣墨盒，透過洗脫液發生器產生氫氧化鈣梯度。以380 μ l / min 嘅流速分離代謝物，應用以下梯度：0至3分鐘，10 mM KOH ； 3至12分鐘，10至50毫米嘅 KOH ； 12至19分鐘，50至100毫米嘅 KOH ； 19至21分鐘，100毫米嘅 KOH ； 21至21.5分鐘，100至10毫米嘅 KOH 。將柱喺10 mM KOH 下重新平衡8.5分鐘。
洗脫出嚟嘅代謝物喺柱之後同150 μ l / min 嘅異丙醇補充流結合，然後引導去一個以負電離模式運作嘅高分辨率質譜計。 MS 監測緊 m/z 50至750嘅質量範圍，分辨率係60，000。 AGC 設定為1 × 106，而最大離子時間保持喺100毫秒。加熱嘅 ESI 源係喺3.5 kV 嘅噴霧電壓下運作。離子源嘅其他設定如下：毛細管溫度275 ° C ；鞘氣體流量，60 AU ；輔助氣體流量，喺300 °C 下係20個天文台，同埋將 S 鏡頭設定為60個天文台。
13C 標記代謝物嘅數據分析。使用 TraceFinder 軟件（版本4.2，熱費爾科學）進行同位素比例嘅數據分析。每種化合物嘅同一性都係由可靠嘅參考化合物驗證，並獨立分析。為咗進行同位素富集分析，每個13C 同位素（ Mn ）嘅提取離子色譜（ XIC ）面積係由 [M + H] + 提取，其中 n 係靶化合物嘅碳數，用嚟分析氨基酸，或者 [ MH ］ + 用嚟分析陰離子。 XIC 嘅質量準確度係小於百萬分之五，而 RT 嘅準確度係0.05分鐘。富集分析係透過計算每個檢測到嘅同位素同相應化合物嘅所有同位素之和嘅比例嚟進行。呢啲比例係以每個同位素嘅百分比值畀出，而結果係以摩爾百分比富集（ MPE ）表示，如之前所講（42）。
將凍結嘅神經元顆粒喺冰冷嘅80 % 甲醇（ v / v ）中均質化，漩渦，然後喺 -20 °C 下溫育30分鐘。再次將樣本旋轉，然後喺 +4 °C 攪拌30分鐘。將樣本喺4 °C 下以21，000 g 離心5分鐘，然後收集所得上清液，並使用 SpeedVac 濃縮器喺25 °C 下乾燥，以便隨後進行分析。如上所述，對分類細胞嘅氨基酸進行 LC-MS 分析。使用 TraceFinder （4.2版，熱費爾科學公司），用每種化合物嘅單同位素質量進行數據分析。代謝物數據嘅分位數標準化係用 preprocessCore 軟件包（57）進行。
切片準備。將小鼠快速用二氧化碳麻醉並斬首，將腦部迅速從頭骨中取出，並使用充冰振動刀（ HM-650 V ，熱費爾科學公司，德國瓦爾多夫）將佢切成300至375 μ m 嘅箭形切片冷碳氣化（925 % + CO氯化鈉、2.5毫米氯化鈉、1.25毫米磷酸鈉緩衝液、25.0毫米氯化鈉、25.0毫米啲葡萄糖、1.0毫米鈣2和6.0毫米汞柱調整至 pH7.4同310至330毫安）。將所得腦片轉移至含有較高 Ca2 + ACSF （125.0 mM NaCl 、2.5 mM KCl 、1.25 mM 磷酸鈉緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-葡萄糖、4.0 mM CaCl2及 mM30.4 至 3.5 Mg2）嘅室中mOsm ）。將啲片儲存20至30分鐘，等佢哋可以喺錄音之前恢復。
錄音。所有記錄都係用一個配備固定記錄室同20倍水浸物鏡（ Scientifica ）嘅顯微鏡台。推定嘅 Purkinje 細胞係透過（ i ）體型、（ ii ）小腦嘅解剖位置，同埋（ iii ）螢光 mtYFP 報告基因嘅表達嚟鑑定。尖端電阻為5至11兆歐嘅貼片吸管由硼硅酸鹽玻璃毛細管（ GB150-10，0.86毫米 × 1.5毫米 × 100毫米，科學產品，德國霍夫海姆）同水平吸管儀器（ P-1000，薩特），加利福尼亞州諾瓦托）拉出。所有錄音都係用 ELC-03XS npi 貼片夾放大器（ npi 電子有限公司，德國 Tam ）進行，呢個放大器係由軟件 Signal （版本6.0，劍橋電子，英國劍橋）控制。實驗係以12.5 kHz 嘅抽樣率記錄。訊號係用兩個短通貝塞爾濾波器濾波，截止頻率分別係1.3同10 kHz 。膜同吸管嘅電容係由用放大器嘅補償電路補償。所有實驗都係喺 Orca-Flash 4.0相機（德國格爾登濱松）嘅控制下進行，而相機係由 Hokawo 軟件（2.8版本，濱松，德國格爾登）控制。
常規嘅全細胞配置同分析。記錄前，立即將含有以下物質嘅內部溶液填充吸管：4.0 mM KCl 、2.0 mM NaCl 、0.2 mM EGTA 、135.0 mM 葡萄糖酸鈣、10.0 mM Hepes 、4.0 mM ATP （ Mg ）、0.5 mM 0 0 0 0 氯化鈉同 0.5 毫升鈉肌酸磷酸調整到 pH 7.25，滲透壓係290 mOsm （蔗糖）。喺施加0 pA 嘅力去破裂膜之後，立即測量靜止膜電位。輸入電阻係透過施加 -40、 -30、 -20同 -10 pA 嘅超極化電流嚟測量。測量電壓響應嘅大小，然後用歐姆定律嚟計算輸入電阻。喺電壓夾中記錄自發活動5分鐘，並使用半自動識別脚本喺 Igor Pro （版本327.01， WaveMetrics ，美國俄勒冈州奧斯維哥湖）中識別同測量 sPSC 。 IV 曲線同穩態電流係透過將電池夾喺唔同電位（由 -110 mV 開始），並以5 mV 步驟增加電壓嚟測量。 AP 嘅產生係透過施加去極電流嚟測試。喺施加去極電流脈衝嘅同時，將電池夾喺 -70 mV 。分別調整每個錄音單元嘅步長（10至60 pA ）。手動計算引起最高 AP 頻率嘅脈衝尖峰，嚟計算最大 AP 頻率。 AP 閾值係用首先觸發一個或多個 AP 嘅去極化脈衝嘅第二微分嚟分析。
穿孔貼片配置同分析。使用標準協議進行穿孔貼片記錄。使用唔含有以下成份嘅冇 ATP 同 GTP 嘅吸管：128 mM 葡萄糖酸 K 、10 mM KCl 、10 mM Hepes 、0.1 mM EGTA 同2 mM MgCl2，並調整至 pH 7.2（使用 KOH ）。細胞內溶液中省略咗 ATP 同 GTP ，以防止細胞膜嘅無法控制嘅渗透性。將貼片吸管充滿含有兩性霉素嘅內部溶液（大約200至250 μ g / ml ； G4888，西格瑪 - 阿爾德里希），以獲得打孔貼片記錄。將兩性黴素溶解喺二甲基亞砜（最終濃度：0.1至0.3 % ； DMSO ； D8418，西格瑪 - 阿爾德里希）。所用嘅 DMSO 濃度對所研究嘅神經元冇顯著影響。喺打孔過程中，持續監測通道電阻（ Ra ），並喺 Ra 同 AP 嘅振幅穩定（20-40分鐘）後開始實驗。自發活動係用電壓同/或電流夾測量2至5分鐘。數據分析係用 Igor Pro （7.05.2版本，美國 WaveMetrics ）、 Excel （2010版本，微軟公司，美國雷德蒙德）同 GraphPad Prism （版本8.1.2， GraphPad 軟件公司，拉霍亞，加利福尼亞州）進行。美國）。為咗識別自發 AP ，我哋用咗 IgorPro 嘅 NeuroMatic v3.0c 插件。使用給定嘅閾值自動識別 AP ，而呢個閾值會根據每個記錄個別調整。用尖峰間隔，用最大瞬間尖峰頻率同平均尖峰頻率去決定尖峰頻率。
PN 隔離。透過適應之前發表嘅方案，喺指定階段從小鼠小腦中純化咗 PNs （ 58 ）。總之，將小腦解剖並喺冰冷嘅解離培養基中切碎 [ 冇 HBSS Ca2 + 同 Mg2 + ，補充20 mM 葡萄糖、青霉素（50 U/ml）同链霉素（0.05 mg/ml）］，然後將培養基消化喺木瓜蛋白酶［HBSS，補充肝素1ml （16 U / 毫升）同脫氧核糖核酸酶 I （ DNase I ；0.1毫克/毫升）］喺30 °C 下處理30分鐘。首先喺室溫下喺含有蛋粘液（10毫克/毫升）、 BSA （10毫克/毫升）同 DNase （0.1毫克/毫升）嘅 HBSS 培養基中洗淨組織，以防止酶消化，然後喺含有 20 毫米葡萄糖嘅 HBSS 培養基中輕輕磨碎 HBSS 、青霉素（50 U/ml ）同鏈球菌1毫克/毫升酶毫克/毫升）釋放單細胞。所得細胞懸濁液經70 μ m 細胞過濾器過濾，然後將細胞離心（1110 rpm，5分鐘，4 ° C ）顆粒化，並重懸浮於分選培養基 [ HBSS ，補充 20 mM 葡萄糖，20 % 胎牛血清，青霉素（50 U / ml ）和 50 mg / ml 。用碘化丙評估細胞活性，並將細胞密度調整為1 × 106至2 × 106細胞 / 毫升。喺流式細胞術之前，將懸濁液經過50 μm 細胞過濾器過濾。
流式細胞計。細胞分類係喺4 °C 下使用 FACSAria III 機器（ BD 生物科學）同 FACSDiva 軟件（ BD 生物科學，版本8.0.1）進行。細胞懸濁液係用100 μ m 噴嘴喺20 psi 嘅壓力下以 ~2800個事件/秒嘅速率進行分類。由於傳統嘅閘控標準（細胞大小、雙峰識別同散射特性）唔能夠確保 PN 同其他細胞類型嘅正確分離，所以閘控策略係根據直接比較 mitoYFP + 同對照 mitoYFP − 小鼠嘅 YFP 強度同自螢光而設定。 YFP 係用488 nm 激光線照射試料而激發，而訊號係用530/30 nm 帶通濾波器檢測。喺 mitoYFP + 小鼠中， Rosa26-mitoYFP 報告基因嘅相對強度亦都係用嚟區分神經元體同軸突片段。 7-AAD 係用561 nm 黃色激光激發，然後用675/20 nm 帶通濾鏡檢測，以排除死細胞。為咗同時分離星形膠質細胞，細胞懸浮液用 ACSA-2-APC 染色，然後用 640 nm 激光線照射樣本，並用 660/20 nm 帶通濾鏡檢測信號。
收集嘅細胞經离心（1110 rpm，5分鐘，4 ° C ）顆粒化，並喺 -80 °C 下儲存直至使用。 Mfn2cKO 小鼠同佢哋嘅幼崽係同一日分類，以最大程度減少程序變異性。 FACS 數據呈現同分析係用 FlowJo 軟件（ FlowJo LLC ，美國俄勒岡州阿什蘭）進行。
如上所述（59），實時 PCR 係用嚟喺分類嘅神經元中分離 DNA ，以便隨後進行 mtDNA 定量。線性度同閾值敏感度最初係透過喺唔同數量嘅細胞上運行 qPCR 嚟測試。總之，喺由50 mM tris-HCl （ pH 8.5）、1 mM EDTA 、0.5 % Tween 20同蛋白酶 K （200 ng/ml ）組成嘅裂解緩衝液中收集300 PN ，然後喺55 °C 溫育120分鐘。將細胞喺95 °C 下進一步溫育10分鐘，以確保蛋白酶 K 完全失活。科學，目錄號 Mm04225274 _ s1）， mt-Nd6（熱費爾科學，目錄號 AIVI3E8）同18S（熱費爾科學，目錄號 Hs99999901 _ s1）基因。
蛋白質組樣本準備。將溶液喺95 °C 加熱10分鐘，然後喺溶解緩衝液 [6 M 氯化胍、10 mM 三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽、10 mM 氯乙酰胺同100 mM 三溶解凍結神經元顆粒喺 HCl 中進行超聲波］。開生物斷路器（迪亞基諾）10分鐘（30秒脈衝/30秒暫停期）。將樣本喺20 mM tris-HCl （ pH 8.0）中稀釋1:10，同300ng胰蛋白酶金（Promega）混合，並喺37 °C 下溫育過夜，以達到完全消化。第二日，將樣本以20，000克離心20分鐘。上清液用0.1 % 甲酸稀釋，然後用自製嘅 StageTips 將溶液脫鹽。將樣本喺 SpeedVac 儀器（埃本多夫濃縮器加5305）喺45 ° C 下乾燥，然後將肽懸浮喺0.1 % 甲酸中。所有樣本都係由同一個人同時準備。為咗分析星形膠質細胞樣本，4 μg 脫鹽肽用串聯質量標籤（ TMT10plex ，目錄號90110，熱費爾科學公司）標記，肽同 TMT 試劑嘅比例係1:20。對於 TMT 標記，將0.8 mg TMT 試劑重懸浮於70 μl 無水 ACN 中，並將乾燥肽重建成9 μl 0.1 M TEAB （碳酸氫三乙基銨），並加入7 μl TMT 試劑於 ACN 中。濃度係43.75 % 。滲透60分鐘後，用2 μl 5 % 羥胺淬滅反應。將標記咗嘅肽收集，乾燥，重懸浮喺200 μ l 0.1 % 甲酸（ FA ）中，分成兩個，然後用自製嘅 StageTips 去鹽。使用 UltiMate 3000超高性能液相色譜機（ UltiMate 3000超高性能液相色譜機），將兩半之一分級喺一個1mm x 150mm嘅 Acquity 色譜柱上，入面充滿130Å1.7μm C18顆粒（沃特斯，目錄號：006915）熱費爾科學）。以30 μ l / min 嘅流速分離肽，由1 % 至50 % 緩衝液 B 分離85分鐘，逐步梯度為96分鐘，由50 % 至95 % 緩衝液 B 分離3分鐘，然後用95 % 緩衝液 B 分離8分鐘；緩衝液 A 係5 % ACN 同10 mM 碳酸氫銨（ ABC ），緩衝液 B 係80 % ACN 同10 mM ABC 。每3分鐘收集一次組分，將佢哋分成兩組（1 + 17、2 + 18等），然後用真空離心機乾燥。
LC-MS/MS 分析。對於質譜，肽（編號 r119. aq ）喺一個25厘米、內徑75 μ m 嘅 PicoFrit 分析柱（新物鏡，部件號 PF7508250）上分離，柱上配備1.9 μ m ReproSil-Pur 120 C18-AQ 培養基（ 120 C18-AQ 培養基），使用 120 C18-AQ 培養基科學，德國）。柱保持喺50 ° C 。緩衝液 A 同 B 分別係水中0.1 % 嘅甲酸同80 % ACN 中嘅0.1 % 甲酸。肽由6 % 至31 % 緩衝液 B 分離65分鐘，由31 % 至50 % 緩衝液 B 分離5分鐘，梯度為200 nl / min 。洗脫後嘅肽喺軌道陷阱融合質譜計（熱費爾科學公司）上進行分析。肽前體 m/z 測量係以120，000嘅分辨率喺350至1500 m/z 嘅範圍內進行。用27 % 嘅正規化碰撞能量，選擇電荷狀態係2至6嘅最強前體進行高能量 C 陷阱解離（ HCD ）裂解。個循環時間設定為1秒。肽片段嘅 m / z 值係用最小嘅 AGC 靶5 × 104同最大注入時間86 ms 喺离子陷阱中測量。喺碎片化之後，將前體放入動態排除清單45秒。將 TMT 標記嘅肽分離喺50 cm、75 μm 嘅 Acclaim PepMap 柱（熱費雪科學公司，目錄號164942）上，然後用配備高場非對稱波形電壓設備（ FAIMS ）操作嘅 Orbitrap Lumos Tribrid 質譜計（熱費雪科學）分析遷移光譜−50同 −70 V 。基於同步前體選擇嘅 MS3係用嚟測量 TMT 報告離子信號。肽分離係喺 EASY-nLC 1200上進行，用90 % 線性梯度洗脫，緩衝濃度係6 % 至31 % ；緩衝液 A 係0.1 % FA ，而緩衝液 B 係0.1 % FA 同80 % ACN 。分析柱係喺50 °C 下運作。使用 FreeStyle （1.6版本，熱費爾科學）根據 FAIMS 補償電壓將原始檔案分割。
蛋白質鑑定同定量。用集成嘅安德羅米達搜索引擎，用 MaxQuant 1.5.2.8版本（ https : / / maxquant . org / ）分析原始數據。除咗由維多利亞水煙得到嘅 Cre 重組酶同 YFP 序列之外，仲搜尋咗肽片段光譜，搵咗小鼠參考蛋白質組嘅正規序列同同型序列（蛋白質組 ID UP000000589，喺2017年5月由 UniProt 下載）。甲硫酸氧化同蛋白質 N 末端乙酰化係設定為可變修飾；半胱氨酸氨基甲酰化係設定為固定修飾。消化參數設定為「特異性」同「胰蛋白酶 / P 」。用嚟驗證蛋白質嘅肽同剃刀肽嘅最少數量係1個；獨特肽嘅最少數量係0。喺肽圖匹配嘅條件下，蛋白質驗證率係0.01。 「第二種肽」選項已經啟用。使用「跑步之間嘅匹配」選項，喺唔同嘅原始檔案之間轉移成功嘅識別資料。使用 LFQ 最低比例計數1進行冇標籤定量（ LFQ ）（60）。 LFQ 強度會喺每個時間點嘅至少一個基因型組別中過濾出至少兩個有效值，並且由寬度為嘅正態分布推斷出嚟。 0.3，然後向下移動1.8。使用珀麗斯計算平台（ https ：// maxquant.net/perseus/ ）同 R （ https ：// r-project . org/ ）去分析 LFQ 結果。差異表達分析係用嚟自 limma 軟件包嘅雙向中度 t 檢驗（61）。探索性數據分析係用 ggplot 、 FactoMineR 、 factoextra 、 GGally 同 pheatmap 進行。基於 TMT 嘅蛋白質組學數據係用 MaxQuant 1.6.10.43版本分析。喺2018年9月下載嘅 UniProt 人類蛋白質組學資料庫入面搜尋原始蛋白質組學數據。呢個分析包括由製造商提供嘅同位素純度校正因子。用 R 入面嘅 limma 嚟做差異表達分析。原始數據、數據庫搜尋結果同埋數據分析工作流程同結果全部都會透過 PRIDE 合作夥伴存儲庫儲存喺 ProteomeXchange 聯盟，數據集識別碼係 PXD019690。
功能註解令分析更加豐富。我哋用咗「創意途徑分析」（ QIAGEN ）工具嚟確定8星期嗰陣數據集嘅功能註釋項嘅豐富程度（圖1）。總之，由 LC-MS / MS （串聯質譜）數據分析得到嘅定量蛋白質清單係用以下嘅過濾準則：選擇肌肉作為物種同背景，而類別顯示由 Benjamini 調整嘅 P 值，富集0.05或以下被視為顯著。對於呢個圖表，顯示咗每個群集中根據調整後嘅 P 值嘅前五個過剩類別。用多重 t 檢驗，用 Benjamini 、 Krieger 同 Yekutieli 嘅兩階段線性提升計劃（ Q = 5 % ），對每個類別中所識別出嚟嘅重要候選物進行時間過程蛋白質表達分析，並且分別分析每行。唔需要採用一致嘅 SD 。
為咗將呢項研究嘅結果同已出版嘅數據庫比較，同埋喺圖1中生成韋恩圖，我哋將定量蛋白質清單同 MitoCarta 2.0注釋結合咗（24）。用網上工具繪製維恩圖（ http : / / 生物信息學 . psb . ugent . be/webtools/维恩/）嚟生成圖表。
有關蛋白質組學分析所用嘅統計程序嘅詳細資料，請參閱材料同方法嘅相應部分。對於所有其他實驗，詳細資料可以喺相應嘅圖例入面搵到。除非另有說明，否則所有數據都以平均值 ± SEM 表示，而所有統計分析都係用 GraphPad Prism 8.1.2軟件進行。
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由 E. 莫托里， I . 阿塔納索夫， SMV 科昌， K . 福爾茨 - 多納胡， V . 薩克蒂維魯， P . 賈瓦利斯科， N . 托尼， J . 普亞爾， N . -G 。拉森
對功能障礙神經元嘅蛋白質組學分析顯示，代謝程式會被激活嚟抵消神經退行性。
由 E. 莫托里， I . 阿塔納索夫， SMV 科昌， K . 福爾茨 - 多納胡， V . 薩克蒂維魯， P . 賈瓦利斯科， N . 托尼， J . 普亞爾， N . -G 。拉森
對功能障礙神經元嘅蛋白質組學分析顯示，代謝程式會被激活嚟抵消神經退行性。
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