唔同嘅植物防禦理論為解釋植物專門代謝嘅模式提供重要嘅理論指引，但係佢哋嘅關鍵預測仍然有待測試。喺呢度，我哋用咗無偏串聯質譜（ MS / MS ）分析，系統噉探討咗由個別植物到群體同密切相關物種嘅煙草衰減菌株嘅代謝組，並且根據資料中嘅複合光譜處理咗大量嘅質譜特徵理論。測試最佳防禦（ OD ）同移動目標（ MT ）理論嘅關鍵預測嘅框架。植物代謝學嘅資訊成分同 OD 理論一致，但係同 MT 理論對食草動物引起嘅代謝學動力學嘅主要預測相矛盾。由微觀到宏觀嘅進化規模，茉莉酸信號被識別為 OD 嘅主要決定因素，而乙烯信號提供咗由 MS/MS 分子網絡註釋嘅食草動物特異反應嘅微調。
具有多樣結構嘅特殊代謝物係植物適應環境嘅主要參與者，特別係防禦敵人（1）。植物中發現嘅特殊代謝嘅驚人多元化，刺激咗幾十年來對佢嘅生態功能嘅許多方面嘅深入研究，亦形成咗一個長長嘅植物防禦理論清單，即係植物同昆蟲相互作用嘅進化同生態發展。實證研究提供咗重要嘅指引（2）。然而，呢啲植物防禦理論並冇遵循假設推斷推理嘅規範路徑，當中關鍵預測係喺同一分析水平（3），並且經過實驗測試，以推進下一個理論發展週期（4）。技術限制將數據收集限制喺特定嘅代謝類別，並且排除對專門代謝物嘅全面分析，因此阻礙咗對理論發展至關重要嘅類別間比較（5）。缺乏全面嘅代謝組學數據同埋一種共同嘅貨幣去比較唔同植物群之間嘅代謝空間嘅處理工作流程，阻礙咗呢個領域嘅科學成熟。
串聯質譜（ MS / MS ）代謝組學領域嘅最新發展可以全面表徵給定系統分支嘅物種內部同物種之間嘅代謝變化，並且可以同計算方法結合嚟計算呢啲複雜混合物之間嘅結構相似性。化學嘅先前知識（5）。分析同計算嘅先進技術嘅結合，為長期測試代謝多樣性嘅生態同進化理論所作出嘅好多預測提供咗必要嘅框架。 Shannon （6）喺1948年嘅開創性文章入面首次引入咗資訊理論，為資訊嘅數學分析奠定咗基礎，而呢個分析除咗佢嘅原始應用之外，已經用喺好多領域。喺基因組學入面，資訊理論已經成功應用喺量化序列保守資訊（7）。喺轉錄組學研究中，資訊理論會分析轉錄組嘅整體變化（8）。喺之前嘅研究中，我哋將資訊理論嘅統計框架應用喺代謝組學，嚟描述植物組織水平嘅代謝專業知識（9）。喺呢度，我哋將基於 MS/MS 嘅工作流程同以共同貨幣嘅代謝多樣性為特徵嘅資訊理論嘅統計框架結合起嚟，比較植物防禦理論對食草動物誘導嘅代謝組嘅關鍵預測。
植物防禦嘅理論框架通常係互相包容嘅，可以分為兩大類別：試圖根據防禦功能解釋植物特異代謝物嘅分佈嘅，例如最佳防禦（ OD ）（10）、移動目標（MT）（11））同外觀（12）理論，而其他人則尋求機械解釋資源可用性嘅變化點樣影響植物生長同專門代謝物嘅累積，例如碳率（14）、平衡：同埋生長同分化平衡假設（15）。兩套理論係喺唔同嘅分析層面（4）。但係，有兩個涉及功能層面嘅防禦功能嘅理論主導咗有關植物構成防禦同誘導防禦嘅對話： OD 理論，假設植物只係喺需要嘅時候先投資佢哋昂貴嘅化學防禦，例如當草動物被攝入嗰陣，因此，根據未來攻擊嘅可能性，會分配具有防禦功能嘅化合物（10）； MT 假設提出，冇定向代謝物變化嘅軸，而係代謝物隨機變化，因此創造咗阻礙攻擊食草動物嘅代謝「運動目標」嘅可能性。換言之，呢兩個理論對食草動物攻擊後發生嘅代謝重建作出相反嘅預測：單向累積代謝物同防禦功能（ OD ）同非定向代謝變化（ MT ）之間嘅關係（11）。
OD 同 MT 假設唔單止涉及代謝組嘅誘導變化，亦都涉及呢啲代謝物累積嘅生態同進化後果，例如呢啲代謝變化喺特定生態環境中嘅適應成本同益處（16）。雖然兩個假設都認同專門代謝物嘅防禦功能，而呢啲功能可能貴，亦可能唔貴，但係分辨 OD 同 MT 假設嘅關鍵預測係誘導代謝變化嘅方向性。 OD 理論嘅預測係到目前為止受到最多實驗關注。呢啲測試包括研究溫室同自然條件下特定化合物嘅唔同組織嘅直接或間接防禦功能，同埋植物發育階段嘅變化（17-19）。但係，到目前為止，由於缺乏一個工作流程同統計框架去全球全面分析任何生物嘅代謝多樣性，兩個理論之間嘅主要差異預測（即係代謝變化嘅方向）仍然有待測試。喺呢度，我哋提供咗一個噉嘅分析。
植物特異代謝物其中一個最重要嘅特徵係佢哋喺所有層面上嘅極端結構多樣性，由單一植物、群體到類似物種（20）。喺人口規模上可以觀察到好多專門代謝物嘅定量變化，而強烈嘅質性差異通常喺物種層面上維持（20）。因此，植物代謝多樣性係功能多樣性嘅主要方面，反映咗對唔同嘅生態位嘅適應能力，特別係嗰啲有唔同嘅特殊昆蟲同常見食草動物入侵可能性嘅生態位（21）。自從 Fraenkel （22）就植物特異代謝物存在嘅原因發表咗突破性嘅文章之後，同各種昆蟲嘅相互作用被視為重要嘅選擇壓力，而呢啲相互作用相信係喺進化過程中塑造咗植物。代謝途徑（23）。專門代謝物多樣性嘅物種間差異亦可能反映咗同構成性同誘導性植物對食草策略嘅防禦相關嘅生理平衡，因為兩種物種經常互相負相關（24）。雖然隨時維持良好嘅防禦可能有益，但係同防禦相關嘅及時代謝變化提供咗明顯嘅好處，令植物可以將寶貴嘅資源分配畀其他生理投資（19，24），同埋避免共生嘅需要。附帶損害（25）。此外，由昆蟲食草動物引起嘅專門代謝物嘅呢啲重組可能會導致群體中嘅破壞性分佈（26），亦可能反映對茉莉酸（ JA ）信號嘅實質自然變化嘅直接讀取，而呢啲變化可能會喺群體中維持。高同低 JA 信號係防禦食草動物同同特定物種競爭之間嘅取捨（27）。此外，專門嘅代謝物生物合成途徑會喺進化過程中經歷快速嘅損失同轉化，導致密切相關嘅物種之間嘅代謝分佈係斑斕嘅（28）。呢啲多態性可以因應食草動物模式嘅變化而快速建立（29），即係話食草動物群落嘅波動係驅動代謝異質性嘅關鍵因素。
喺呢度，我哋特別解決咗以下嘅問題。 （一）食草昆蟲係點樣重新配置植物代謝組？ （二）代謝可塑性嘅主要資訊成分係咩，可以量化嚟測試長期防禦理論嘅預測？ （三）係咪要以攻擊者獨有嘅方式重新編程植物代謝組，如果係，植物荷爾蒙喺度身訂造特定嘅代謝反應方面發揮咩作用，同埋邊啲代謝物有助於防禦嘅物種特異性？ （四）由於好多防禦理論所作出嘅預測可以擴展到生物組織嘅所有層面，我哋問咗由內部比較到物種間比較，所引起嘅代謝反應有幾一致？為此，我哋系統地研究咗煙草尼古丁嘅葉代謝組，呢種係一種生態模型植物，有豐富嘅專門化代謝，對兩種原生食草動物嘅幼蟲有效，即係鱗翅目曼陀羅（ Ms ）（非常攻擊性，主要食用）喺茄科同海岸線夜蛾（ Sl ）上，棉花葉蟲同其他寄主植物嘅葉蟲係一種寄主植物屬同科植物食物。我哋解析咗 MS/MS 代謝組學光譜，並提取咗資訊理論統計描述子，嚟比較 OD 同 MT 理論。建立特異性圖，嚟揭示關鍵代謝物嘅身份。分析延伸到 N. nasi 嘅原生種群同密切相關嘅煙草物種，以進一步分析植物激素信號傳導同 OD 誘導之間嘅協方差。
為咗捕捉一個關於食草煙草葉代謝組嘅可塑性同結構嘅整體地圖，我哋用咗之前開發嘅分析同計算工作流程，全面收集同解卷積植物提取物嘅高分辨率數據獨立 MS/MS 光譜（9）。呢個未分化嘅方法（叫做 MS/MS ）可以構建非冗餘嘅化合物光譜，然後可以用喺呢度所講嘅所有化合物水平分析。呢啲解卷積植物代謝物有唔同類型，由幾百至幾千種代謝物組成（呢度大約係500-1000秒/MS/MS）。喺呢度，我哋喺資訊理論嘅框架入面考慮代謝可塑性，並根據代謝頻率分佈嘅香農熵量化代謝組嘅多樣性同專業性。我哋用之前實現嘅公式（8）計算咗一組指標，可以用嚟量化代謝組多樣性（ Hj 指標）、代謝特徵專化（ δ j 指標）同埋單一代謝物嘅代謝特異性（ Si 指標）。此外，我哋應用咗相對距離可塑性指數（ RDPI ）去量化食草動物嘅代謝組誘導性（圖1A）（30）。喺呢個統計框架入面，我哋將 MS/MS 光譜當成基本嘅資訊單位，同埋將 MS/MS 嘅相對丰度處理成頻率分佈圖，然後用香農熵嚟估計代謝組多樣性。代謝組專門化係用單一 MS/MS 光譜嘅平均特異性嚟量度。因此，食草動物誘導後部分 MS/MS 類別嘅丰度增加會轉化為光譜誘導性、 RDPI 同專門化，即係 δ j 指數嘅增加，因為會產生更專門嘅代謝物，並且產生高 Si 指數。 Hj 多樣性指數嘅降低反映咗一係生成嘅 MS/MS 數量減少，一係輪廓頻率分佈向較唔均勻嘅方向變化，同時降低咗佢嘅整體唔確定性。透過 Si 指數計算，可以突顯出邊啲 MS/MS 係由某啲食草動物誘導，相反，邊啲 MS/MS 對誘導冇反應，呢個係區分 MT 同 OD 預測嘅關鍵指標。
(A) 用於食草（ H1至 Hx ） MS/MS 數據誘導性（ RDPI ）、多樣性（ Hj 指數）、專化（ δ j 指數）同代謝物特異性（ Si 指數）嘅統計描述子。專門化程度嘅增加（ δ j ）表明，平均嚟講，會產生更多嘅食草特定代謝物，而多樣性（ Hj ）嘅減少表明代謝物嘅生產減少，或者代謝物喺分佈圖中嘅分佈唔均勻。 Si 值評估代謝物係咪特定於特定條件（呢度係食草動物），定係反之亦然維持喺同一水平。 (B) 使用資訊理論軸進行防禦理論預測嘅概念圖。 OD 理論預測食草動物嘅攻擊會增加防禦代謝物，從而增加 δ j 。同時， Hj 會降低，因為個輪廓會重組，以減少代謝資訊嘅不確定性。 MT 理論預測食草動物嘅攻擊會引起代謝組嘅非方向性變化，從而增加 Hj 作為代謝資訊不確定性增加嘅指標，並引起 Si 嘅隨機分佈。我哋亦提出咗一個混合模型，即係最佳 MT ，其中一啲具有較高防禦值嘅代謝物會特別增加（高 Si 值），而其他代謝物就會表現出隨機反應（較低 Si 值）。
我哋用資訊理論描述符去解釋 OD 理論，預測食草動物喺未誘導嘅構成狀態下誘導嘅特殊代謝物變化會導致（ i ）代謝特異性（ Si 指數）嘅增加，驅動代謝特異性（ δ j 指數）嘅某啲具有較高防禦值嘅特殊代謝物群嘅增加，同埋（ ii ）由於代謝體分布頻率嘅變化，代謝體多樣性（ Hj 指數）嘅減少。喺單一代謝物嘅層面，預期會有有序嘅 Si 分佈，代謝物會根據佢嘅防禦值增加 Si 值（圖1B ）。沿住呢條線，我哋解釋咗 MT 理論，預測刺激會導致（ i ）代謝物嘅非方向性變化，導致 δj 指數下降，同埋（ ii ）由於代謝唔確定性嘅增加， Hj 指數增加。或者係隨機性，呢個可以用香農熵以廣義多樣性嘅形式去量化。至於代謝組成， MT 理論會預測 Si 嘅隨機分佈。考慮到某啲代謝物喺特定條件下喺特定條件下，而其他條件就唔係喺特定條件下，而佢哋嘅防禦價值取決於環境，我哋亦提出咗一個混合防禦模型，其中 δj 同 Hj 沿住 Si 分佈成兩個，向所有方向增加，只有某啲代謝物基團，佢哋嘅防禦值較高，先會特別增加 Si ，而其他嘅就會有隨機分佈（圖1B ）。
為咗喺資訊理論描述子嘅軸上測試重新定義嘅防禦理論預測，我哋喺黑松葉上養咗專家（ Ms ）或者一般（ Sl ）食草動物幼蟲（圖2A ）。我哋用 MS/MS 分析，喺毛蟲餵食後收集嘅葉組織嘅甲醇提取物中擷取咗599個非冗餘嘅 MS/MS 光譜（資料檔案 S1）。用 RDPI 、 Hj 同 δj 索引去可視化 MS/MS 配置檔案入面嘅資訊內容重新配置，可以睇到有趣嘅模式（圖2B ）。整體趨勢係，正如資訊描述符所描述，隨住毛蟲繼續食葉，所有代謝重組嘅程度都會隨時間增加：食草動物食完之後72小時， RDPI 會明顯增加。同未受損嘅對照相比， Hj 明顯降低，呢個係因為代謝特徵嘅專門化程度增加，而呢個係用 δj 指數量化嘅。呢個明顯嘅趨勢同 OD 理論嘅預測一致，但係同 MT 理論嘅主要預測唔一致，因為 MT 理論認為代謝物水平嘅隨機（非定向）變化係用作防禦迷彩（圖1B ）。雖然呢兩種食草動物嘅口腔分泌物（ OS ）誘導物含量同餵食行為都唔同，但係佢哋嘅直接餵食導致24小時同72小時嘅收穫期間， Hj 同 δj 嘅方向有類似嘅變化。唯一嘅分別係喺 RDPI 72小時發生。同由 Ms 餵養引起嘅相比，由 Sl 餵養引起嘅整體代謝係較高。
(A) 實驗設計：普通豬（ S1）或專家（ Ms ）食草動物會用投手植物嘅脫盐葉餵食，而對於模擬食草動物， Ms （ W + OSMs ）嘅 OS 係用嚟處理標準化葉位置傷口嘅穿刺。 S1（ W + OSSl ）幼蟲或水（ W + W ）。對照組（ C ）係一片未受損嘅葉。 （ B ）為特殊代謝物圖計算嘅誘導性（ RDPI 同對照圖相比）、多樣性（ Hj 指數）同專門化（ δ j 指數）指數（599 MS / MS ；資料檔案 S1）。星號表示直接食草動物餵食同對照組之間有顯著差異（學生 t 檢驗同配對 t 檢驗， * P < 0.05同 *** P < 0.001）。 ns ，唔重要。 (C) 模擬食草處理後主要（藍色框、氨基酸、有機酸同糖；數據檔案 S2）同特殊代謝物光譜（紅色框 443 MS / MS ；數據檔案 S1）嘅時間分辨率指數。顏色波段係指95 % 置信區間。星號表示治療同對照之間嘅顯著差異［二次方差分析（ ANOVA ），其次係事後多重比較嘅 Tukey 誠實顯著差異（ HSD ）， * P < 0.05， ** P < 0.01同 *** P < 0.001］。 (D) 散點圖同特殊代謝物分佈嘅專門化（用唔同處理嘅重複樣本）。
為咗探討食草動物喺代謝組層面上誘導嘅重建係咪反映喺個別代謝物水平嘅變化，我哋首先將重點放喺之前研究過喺有證明食草動物抗性嘅 Nepenthes pallens 嘅葉入面嘅代謝物。酚酰胺係羥基肉桂酰胺 - 多胺結合物，喺昆蟲嘅食草過程中累積，而且已知會降低昆蟲嘅表現（32）。我哋搜尋咗相應嘅 MS/MS 嘅前體，並繪製咗佢哋嘅累積動力學曲線（圖 S1）。唔出奇，唔直接參與對食草動物嘅防禦嘅酚類衍生物，例如綠原酸（ CGA ）同蘆丁，喺食草動物之後會下調。相反，食草動物可以令到酚酰胺變得非常有效。兩種食草動物嘅持續餵食導致酚酰胺嘅激發光譜幾乎相同，而呢個模式對於酚酰胺嘅從頭合成尤其明顯。當探討17-羟基香葉基非烯二醇二萜糖苷（17-HGL-DTGs ）途徑時，亦會觀察到同樣嘅現象，呢個途徑會產生大量具有有效抗食草功能嘅非環二萜（33），其中 Ms Feeding with Sl 觸發咗類似嘅表達特徵（圖 S1））。
直接食草動物餵食實驗嘅可能缺點係食草動物嘅葉消耗率同餵食時間嘅差異，令到難以消除傷口同食草動物所引起嘅食草動物特定影響。為咗更好噉解決誘導葉代謝反應嘅食草動物物種特異性，我哋透過立即將新鮮收集嘅 OS （ OSM 同 OSS1）應用喺一致嘅葉位置嘅標準穿刺 W ，模擬咗 Ms 同 Sl 幼蟲嘅餵食。呢個程序叫做 W + OS 治療，佢會透過精確計時食草動物引起嘅反應嘅開始，嚟標準化誘導，而唔會引起組織損失速率或量嘅差異嘅混淆效應（圖2A）（34）。我哋用 MS/MS 分析同計算管道，擷取咗443個 MS/MS 光譜（數據檔案 S1），呢啲光譜同之前由直接進料實驗組裝嘅光譜重疊。呢個 MS/MS 數據集嘅資訊理論分析顯示，透過模擬食草動物對葉特異代謝組嘅重新編程顯示出 OS 特異誘導（圖2C ）。特別係，同 OSS1治療相比， OSM 喺4小時引起代謝組專化嘅增強。值得注意嘅係，同直接食草動物餵食實驗數據集相比，用 Hj 同 δj 作為座標喺二維空間中可視化嘅代謝動力學，而代謝組專化嘅方向性係隨住時間嘅推移而增加一致（圖2D ）。同時，我哋量化咗氨基酸、有機酸同糖嘅含量（數據檔案 S2），嚟調查呢個針對性嘅代謝組專業知識增加係咪因為中央碳代謝對模擬食草動物嘅反應而重新配置（圖 S2）。為咗更好噉解釋呢個模式，我哋進一步監測咗之前討論過嘅酚酰胺同17-HGL-DTG 途徑嘅代謝累積動力學。食草動物嘅 OS 特異誘導係轉化為酚酰胺代謝內嘅差異重排模式（圖 S3）。含有香豆素同咖啡酰部分嘅酚酰胺優先由 OSS1誘導，而 OSM 會觸發阿魏酰結合物嘅特異誘導。對於17-HGL-DTG 途徑，檢測到下游馬洛尼化同二馬洛尼化產物嘅差異性 OS 誘導（圖 S3）。
接下來，我哋用時間過程微陣列數據集研究咗 OS 誘導嘅轉錄組可塑性，呢個數據集模擬咗用 OSM 去處理食草動物嘅玫瑰花狀植物葉嘅葉。抽樣動力學基本上同呢個代謝組學研究所用嘅動力學重疊（35）。同代謝可塑性隨時間特別增加嘅代謝組重構相比，我哋觀察到由 Ms 誘導嘅葉片中嘅瞬時轉錄爆發，其中轉錄組誘導性（ RDPI ）同專化（ δ j ）喺1小時內有顯著增加，而多樣性（ Hj ）喺呢個時間點， BMP1嘅表達明顯降低，其次係轉錄組嘅特異化（圖4）。代謝基因家族（例如 P450、糖基轉移酶同 BAHD 酰基轉移酶）參與咗由一級代謝衍生嘅結構單位組裝特殊代謝物嘅過程，遵循上述早期嘅高專門化模型。作為個案研究，分析咗苯丙氨酸途徑。分析證實咗酚酰胺代謝嘅核心基因喺食草動物中係高度 OS 誘導，相比起未被吸引嘅植物，而且佢哋嘅表達模式密切相關。呢個途徑上游嘅轉錄因子 MYB8同結構基因 PAL1、 PAL2、 C4H 同4CL 都顯示出轉錄嘅早期開始。喺酚酰胺嘅最終組裝中發揮作用嘅酰基轉移酶，例如 AT1、 DH29同 CV86，都表現出長期嘅上調模式（圖 S4）。上述觀察結果表明，轉錄組專化嘅早期開始同代謝組學專化嘅後期增強係一種耦合模式，可能係因為同步調節系統引發咗強大嘅防禦反應。
植物荷爾蒙信號嘅重新配置充當一個調節層，整合食草資訊嚟重新編程植物嘅生理。喺食草動物模擬之後，我哋測量咗關鍵植物荷爾蒙類別嘅累積動態，並可視化咗佢哋之間嘅時間共表達［皮爾遜相關係數（ PCC ） > 0.4］（圖3A ）。正如預期，同生物合成有關嘅植物荷爾蒙係喺植物荷爾蒙共表達網絡入面連結埋一齊。另外，代謝特異性（ Si index ）會映射到呢個網絡，嚟突顯唔同處理方法所誘導嘅植物荷爾蒙。我哋畫咗兩個主要嘅食草動物特異反應領域：一個係喺 JA 群， JA （佢嘅生物活性形式 JA-Ile ）同其他 JA 衍生物顯示出最高嘅 Si 分數；另一個係乙烯（ ET ）。吉伯林只係顯示出食草動物嘅特異性有中度增加，而其他植物荷爾蒙，例如細胞分裂素、生長素同脫落酸，對食草動物嘅誘導特異性低。同單獨使用 W + W 相比，透過 OS 應用（ W + OS ）擴大 JA 衍生物嘅峰值基本上可以轉化為 JAs 嘅強特異指標。估唔到，已知唔同誘發子含量嘅 OSM 同 OSS1會引起類似嘅 JA 同 JA-Ile 嘅累積。同 OSS1相反， OSM 係由 OSM 特異同強烈誘導，而 OSS1唔會放大基底傷口嘅反應（圖3B ）。
(A) 基於 PCC 計算嘅食草動物誘導植物激素累積動力學模擬嘅共表達網絡分析。節點代表單一植物激素，而節點嘅大小代表處理之間植物荷爾蒙特有嘅 Si 指數。 (B) 由唔同顏色表示嘅唔同處理引起嘅葉中 JA 、 JA-Ile 同 ET 嘅積累：杏、 W + OSM ；藍色， W + OSSl ；黑色， W + W ；灰色， C （對照）。星號表示治療同對照之間有顯著差異（雙向方差分析，然後係 Tukey HSD 事後多重比較， *** P < 0.001）。對 JA 生物合成同感知光譜受損（ irAOC 同 irCOI1）嘅（ C ）697 MS/MS （資料檔案 S1）同 ET 信號受損嘅 ETR1 中（ D ）585 MS/MS（資料檔案 S1）進行資訊理論分析兩種模擬食草動物處理觸發咗植物系同空載體（ EV ）對照植物。星號表示 W + OS 治療同未受損對照之間有顯著差異（雙向分散分析，然後進行 Tukey HSD 事後多重比較， * P < 0.05， * * P < 0.01同 * * * P < 0.001）。 (E) 對專業化嘅分散對立嘅散點圖。啲顏色代表唔同嘅基因改造菌株；啲符號代表唔同嘅處理方法：三角形， W + OSS1；長方形， W + OSM ；圈 C
接下來，我哋喺 JA 同 ET 生物合成（ irAOC 同 irACO ）同感知（ irCOI1同 sETR1）嘅關鍵步驟中，用一種基因改造嘅減毒豬瘟菌株（ irCOI1同 sETR1）去分析呢兩種植物荷爾蒙對食草動物嘅代謝同重新編程嘅相對貢獻。同之前嘅實驗一致，我哋證實咗食草動物 -OS 喺空載體（ EV ）植物中嘅誘導（圖3， C 至啲），同埋由 OSM 引起嘅 Hj 指數嘅整體下降，而 δj 指數就增加。呢個反應比起 OSS1觸發嘅反應更加明顯。以 Hj 同 δj 為座標嘅兩線圖顯示咗特定嘅解調（圖3E ）。最明顯嘅趨勢係，喺缺乏 JA 信號嘅菌株中，由食草動物引起嘅代謝組多樣性同專化變化幾乎完全消除（圖3C ）。相反 , sETR1植物嘅靜音 ET 感知，雖然對食草代謝變化嘅整體影響比 JA 信號低好多，但係會衰弱 OSM 同 OSS1刺激之間嘅 Hj 同 δj 指數嘅差異 ( 圖3D 同圖 S5 ) 。 。呢個表明除咗 JA 信號轉導嘅核心功能之外， ET 信號轉導亦都係食草動物物種特異代謝反應嘅微調。同呢個微調功能一致， sETR1植物嘅整體代謝組誘導性冇變化。另一方面，同 sETR1植物相比， irACO 植物誘導咗由食草動物引起嘅代謝變化嘅整體振幅相似，但係喺 OSM 同 OSS1挑戰之間顯示出顯著唔同嘅 Hj 同 δj 得分（圖 S5）。
為咗鑑別對食草動物嘅物種特異反應有重要貢獻嘅專門代謝物，同埋透過 ET 信號微調佢哋嘅生產，我哋用咗之前開發嘅結構 MS/MS 方法。呢個方法係依賴雙聚類方法，從 MS/MS 片段 [ 正規化點積（ NDP ）］同基於中性損失（ NL ）嘅相似性評分重新推斷代謝家族。透過 ET 轉基因系嘅分析構建嘅 MS/MS 數據集產生咗585個 MS/MS （數據檔案 S1），呢個數據係透過將佢哋聚類成七個主要嘅 MS/MS 模組（ M ）嚟解決（圖4A ）。呢啲模組有啲係密集地充滿咗之前表徵過嘅特殊代謝物：例如， M1、 M2、 M3、 M4同 M7富含各種酚衍生物（ M1）、黃酮糖苷（ M2）、酰基糖（ M3同 M4）同埋17-HGL-DTG （ M7）。另外，計算咗每個模組入面單一代謝物嘅代謝特異資訊（ Si 指數），並且可以直覺噉睇到佢嘅 Si 分佈。總之，表現出高食草性同基因型特異性嘅 MS/MS 光譜嘅特點係高 Si 值，而峰度統計顯示咗右尾角嘅毛皮分佈。其中一個噉嘅瘦膠體分布係喺 M1中檢測到，其中酚酰胺顯示出最高嘅 Si 分量（圖4B ）。前面提到嘅 M7中嘅食草誘導17-HGL-DTG 顯示出中度嘅 Si 評分，表明兩種 OS 類型之間有中度程度嘅差異調節。相反，大部分構成性生產嘅專門代謝物，例如蘆丁、 CGA 同酰基糖，都係最低嘅 Si 分數。為咗更好噉探討特殊代謝物之間嘅結構複雜性同 Si 分佈，為每個模組構建咗一個分子網絡（圖4B ）。 OD 理論嘅一個重要預測（喺圖1B 中概括）係，食草後特殊代謝物嘅重組應該會導致具有高防禦價值嘅代謝物嘅單向變化，特別係透過增加佢哋嘅特異性（而唔係隨機分佈模式） MT 理論預測嘅防禦代謝物。大部分累積喺 M1嘅酚類衍生物都同昆蟲表現嘅下降有功能關係（32）。當比較 EV 對照植物嘅誘導葉同組成葉之間嘅 M1代謝物喺24小時嘅 Si 值嗰陣，我哋觀察到食草昆蟲之後好多代謝物嘅代謝特異性有顯著增加嘅趨勢（圖4C ）。只係喺防禦性酚酰胺中檢測到 Si 值嘅特異增加，但係喺呢個模組中共存嘅其他酚同未知代謝物中冇檢測到 Si 值嘅增加。呢個係一個專門嘅模型，同 OD 理論有關。食草動物引起嘅代謝變化嘅主要預測係一致嘅。為咗測試呢個酚酰胺光譜嘅特殊性係咪由 OS 特異性 ET 誘導，我哋繪製咗代謝物 Si 指數，並引起咗 EV 同 sETR1基因型中 OSM 同 OSS1之間嘅差異表達值（圖4D ）。喺 sETR1中，苯胺誘導嘅 OSM 同 OSS1之間嘅差異大大降低。雙聚類方法亦都應用喺喺冇足夠 JA 嘅菌株中收集嘅 MS/MS 數據，以推斷同 JA 調節代謝專化有關嘅主要 MS/MS 模組（圖 S6）。
（ A ）基於共享片段（ NDP 相似性）同共享中性損失（ NL 相似性）嘅 585 MS/MS 嘅聚類結果，導致模組（ M ）同已知嘅化合物家族一致，或者係由未知或者代謝不良嘅代謝物組成。每個模組旁邊都顯示咗代謝物（ MS / MS ）特異（ Si ）分佈。 （ B ）模塊化分子網絡：節點代表 MS/MS 同邊緣， NDP （紅色）同 NL （藍色） MS/MS 分數（截止值， > 0.6）。分級代謝物特異性指數（ Si ）係根據模組（左）着色，並映射到分子網絡（右）。 （ C ）24小時嘅 EV 植物嘅組成（對照）同誘導狀態（模擬食草動物）嘅模組 M1：分子網絡圖（ Si 值係節點大小，防禦酚酰胺以藍色突顯）。 （ D ） EV 同 ET 感知受損嘅光譜線 sETR1嘅 M1分子網絡圖：綠色圈節點所代表嘅酚類化合物，同埋 W + OSM 同 W + OSS1處理之間嘅顯著差異（ P 值）作為節點大小。 CP ， N- 咖啡酰 - 酪氨酸； CS ， N- 咖啡酰 - 精胺酸； FP ， N- 阿魏酸酯 - 尿酸； FS ， N- 阿魏基 - 精氨酸； CoP ， N ' ， N 「 - 香豆素 - 酪氨酸； DCS ， N ' ， N 」 - 二咖啡酰 - 精氨酸； CFS ， N ' ， N ” - 咖啡酰基，阿魏酰 - 精氨酸；枸杞子中嘅枸杞子； Nick . O-AS ， O- 酰基糖。
我哋進一步將分析由單一衰弱嘅豬籠草基因型擴展到自然群體，之前已經喺自然群體中描述過食草動物 JA 水平同特定代謝物水平嘅強烈種內變化（26）。用呢個數據集嚟覆蓋43種種質。呢啲種質係由123種嚟自 N. pallens 嘅植物組成。呢啲植物係喺猶他州、內華達州、亞利桑那州同加州嘅唔同原生棲息地收集嘅種子入面攞嚟嘅（圖 S7），我哋計算咗代謝組多樣性（呢度叫做人口水平） β 多樣性）同埋 OSM 引起嘅專門化。同之前嘅研究一致，我哋觀察到沿 Hj 同 δj 軸有廣泛嘅代謝變化，表明種質對食草動物嘅代謝反應嘅可塑性有顯著差異（圖 S7）。呢個組織令人聯想到之前對食草動物引起嘅 JAs 變化嘅動態範圍嘅觀察，而且喺單一群體中保持咗非常高嘅值（26，36）。透過用 JA 同 JA-Ile 嚟測試 Hj 同 δj 之間嘅整體水平相關性，我哋發現 JA 同代謝組 β 多樣性同專化指數之間有顯著嘅正相關（圖 S7）。呢個表明，喺群體層面上檢測到嘅食草動物誘導嘅 JAs 誘導異質性可能係因為由昆蟲食草動物選擇引起嘅關鍵代謝多態性。
以往嘅研究顯示，煙草類型嘅類型同對誘導同構成代謝防禦嘅相對依賴性有好大分別。相信呢啲抗食草動物信號轉導同防禦能力嘅變化係受到特定物種生長嘅生態位嘅昆蟲群落壓力、植物生命週期同埋防禦生產成本所調節。我哋研究咗六種原產於北美洲同南美洲嘅食草動物誘導嘅葉代謝組重建嘅一致性。呢啲物種同北美嘅豬瘟有密切關係，即係尼古拉斯 · 博西弗洛。 La, N. 尼古丁，尼古丁 n 。衰弱草、煙草煙草、線性煙草、煙草（ spegazzinii ）同煙葉煙草（鈍葉煙草）（圖5A ）（37）。其中 6 種，包括特徵良好嘅 N. please , 係矮人分支嘅一年生植物，而 obtusifolia N. 係姊妹分支三角葉嘅多年生植物（38）。隨後，對呢 7 種物種進行 W + W 、 W + OSM 同 W + OSS1誘導，以研究昆蟲餵食嘅物種層面代謝重新排列。
(A) 基於最大可能性［用於核谷氨酰胺合成（38）］同埋七種密切相關嘅煙草物種（唔同顏色）嘅地理分佈嘅引導系統發育樹（37）。 (B) 七種尼古丁物種代謝特徵嘅專門多樣性散點圖（939 MS / MS ；資料檔案 S1）。喺物種層面，代謝組多樣性同專門化程度有負相關。代謝多樣性同專門化同 JA 累積之間嘅物種層面相關性分析如圖2所示。顏色，唔同類型；三角形， W + OSS1；長方形， W + OSM ； （ C ）尼古丁 JA 同 JA-Ile 動力學係根據 OS 激發振幅排名（雙向方差分析同 Tukey HSD 後多重比較， * P <0.05，** P <0.01同 * ** 對於 W + OS 同 W + W 嘅比較， P < 0.001）。模擬食草動物同甲基 JA （ MeJA ）後，每種物種嘅（ D ）多樣性同（ E ）專門化嘅箱形圖。星號表示 W + OS 同 W + W 或者羊毛脂加 W （ Lan + W ）或者 Lan 加 MeJA （ Lan + MeJa ）同 Lan 對照之間嘅顯著差異（雙向方差分析，其次係 Tukey 嘅 HSD 事後多重比較， * P < 0.05， ** P < 0.01同 *** P < 0.001）。
用雙聚類方法，我哋識別咗9個939 MS/MS 嘅模組（數據檔案 S1）。由唔同處理方式重新配置嘅 MS/MS 組成喺物種之間嘅唔同模組之間有好大嘅差異（圖 S8）。可視化 Hj （呢度稱為物種層面嘅 γ 多樣性）同 δ j 可以發現唔同物種喺代謝空間中聚集成非常唔同嘅群體，而物種層面嘅分裂通常比刺激更加突出。除咗線性蟲同斜蟲之外，佢哋都展現出廣泛嘅動態範圍嘅感應效應（圖5B ）。相反，紫草蟲同鈍葉蟲等物種對治療嘅代謝反應唔太明顯，但係代謝組就更加多樣化。誘導代謝反應嘅物種特異分佈導致專門化同伽馬多樣性之間嘅顯著負相關（ PCC = -0.46， P = 4.9 × 10-8）。 OS 誘導嘅 JAs 水平變化同代謝組專門化有正相關，同每個物種所展現嘅代謝伽馬多樣性有負相關（圖5B 同圖 S9）。值得注意嘅係，圖5C 中口語上稱為「信號反應」嘅物種，例如豬瘟線蟲、豚鼠線蟲、急性豚鼠同衰弱嘅豚鼠，喺30分鐘後引起顯著嘅症狀。最近嘅 OS 特異性 JA 同 JA-Ile 爆發，而其他被稱為「信號冇反應」嘅細菌，例如豬瘟、粉狀豬瘟同圓葉草，只係顯示出 JA-Ile Edge 誘導，而冇任何 OS 特異性（圖5C ）。喺代謝層面，如上所述，對於衰弱嘅豬籠草，信號反應物質顯示出 OS 特異性，並且顯著增加 δ j ，同時降低 Hj 。喺被歸類為信號非反應物種嘅物種中未檢測到呢種 OS 特異性引發效應（圖5、啲同 E ）。 OS 特異代謝物係信號反應物種之間更頻繁共享，而呢啲信號群會同信號反應較弱嘅物種聚集，而信號反應較弱嘅物種則顯示出較少嘅相互依賴關係（圖 S8）。呢個結果表明 JAs 嘅 OS 特異誘導同下游代謝組嘅 OS 特異重構係喺物種層面上耦合嘅。
接下來，我哋用咗一種含有甲基 JA （ MeJA ）嘅羊毛脂膏去處理植物，嚟研究呢啲偶聯模式係咪受到外源 JA 所施加嘅 JA 嘅可用性所限制，而呢啲 JA 會喺植物嘅細胞質入面。快速脫酯係 JA 。我哋發現由於 JA 嘅持續供應，由有信號反應嘅物種逐漸變成冇信號嘅物種嘅趨勢係相同嘅（圖5、啲同 E ）。總之， MeJA 處理強烈重新編程咗線性線蟲、斜線蟲、水線蟲、黑線蟲同木本線蟲嘅代謝組，導致 δ j 顯著增加同 Hj 下降。紫蟲只係顯示出 δ j 嘅增加，但係 Hj 就冇。之前已經被證明累積極低水平嘅 JAs 嘅 N. obtusifolia ，喺代謝組重構方面對 MeJA 治療嘅反應亦都好差。呢啲結果表明，喺信號冇反應嘅物種中， JA 嘅生產或者信號轉導係受到生理上嘅限制。為咗測試呢個假設，我哋研究咗由 W + W 、 W + OSMs 同 W + OSS1轉錄組誘導嘅四種（ N . pallens 、 N . mills 、 N. 粉紅色同 N. microphylla ）（39）。同代謝組重建嘅模式一致，呢啲物種喺轉錄組空間中分離得好好，其中 N. weakened 顯示出最高嘅 OS 誘導 RDPI ，而 N. gracilis 則顯示出最低（圖6A ）。但係，發現由 N. oblonga 誘導嘅轉錄組多樣性係四種中最低，同之前喺七種物種中顯示嘅最高 N. oblonga 嘅最高代謝多樣性相反。先前嘅研究顯示，一組同早期防禦信號有關嘅基因，包括 JA 信號，可以解釋尼古丁物種中由食草動物相關誘導子誘導嘅早期防禦反應嘅特異性（39）。比較呢四種物種之間嘅 JA 信號通路，發現咗一個有趣嘅模式（圖6B ）。呢個途徑入面嘅大部分基因，例如 AOC 、 OPR3、 ACX 同 COI1，喺呢四種物種中都顯示出相對高水平嘅誘導。然而，一個關鍵基因， JAR4，將 JA 轉化成佢嘅生物活性形式嘅 JA-Ile 累積轉錄物，而佢嘅轉錄水平好低，特別係喺 N. mills 、 N. pieris 同 N. microphylla 。另外，喺雙歧桿菌中只係檢測到另一個基因 AOS 嘅轉錄物。呢啲基因表達嘅變化可能係由信號無能物種嘅低 JA 產生同 N. gracilis 嘅誘導所引起嘅極端表型嘅原因。
(A) 食草誘導後30分鐘抽樣嘅四種密切相關嘅煙草物種嘅早期轉錄反應重新編程嘅資訊理論分析。 RDPI 係透過比較食草動物 OS 誘導嘅葉同傷口對照嚟計算。顏色表示唔同物種，而符號表示唔同嘅處理方法。 (B) 四種物種之間 JA 信號通路嘅基因表達分析。簡化咗嘅 JA 路徑會喺方框圖旁邊顯示。唔同顏色表示唔同嘅加工方法。星號表示 W + OS 治療同 W + W 對照之間有顯著差異（對於成對差異嘅學生 t 檢驗， * P < 0.05， * * P < 0.01同 * * * P < 0.001）。 OPDA ，12-氧代植物二酸； OPC-8：0，3-氧代-2（2′（Z）-戊烯基）-環戊烷-1-辛酸。
喺最後一部分，我哋研究咗唔同植物種類嘅代謝組嘅昆蟲物種特異重建係點樣可以對食草動物有抗性。之前嘅研究強調咗尼古丁屬。佢哋對 Ms 同幼蟲嘅抵抗力有好大分別（40）。喺呢度，我哋研究咗呢個模型同佢哋嘅代謝可塑性之間嘅關係。利用上述四種煙草種類，並測試食草動物引起嘅代謝組嘅多樣性同專化同植物對 Ms 同 Sl 嘅抗性之間嘅相關性，我哋發現對通才 Sl All 嘅抗性、多樣性同專化係正相關，而對專家女士嘅抗性同專化之間嘅相關性係弱，而同多樣性嘅相關性唔顯著（圖 S10）。至於 S1抗性，之前被證明同時展現出 JA 信號轉導水平同代謝組可塑性嘅減毒 N. chinensis 同 N. gracilis ，對食草動物誘導嘅反應都好唔同，而且佢哋亦都顯示出類似嘅高抗性。性愛。
喺過去六十年，植物防禦理論提供咗一個理論框架，基於呢個框架，研究者預測咗相當多植物專門代謝物嘅進化同功能。呢啲理論大部分都唔遵循強推論嘅正常程序（41）。佢哋喺同一分析層面提出關鍵預測（3）。當關鍵預測嘅測試可以分析特定嘅理論，噉就會令到個領域向前行。被支持，但係拒絕其他人（42）。相反，新理論會喺唔同嘅分析層面上作出預測，並且增加一層新嘅描述性考慮（42）。然而，喺功能層面提出嘅兩個理論， MT 同 OD ，可以好容易解釋為食草動物引起嘅專門代謝變化嘅重要預測： OD 理論認為專門代謝「空間」嘅變化係高度定向嘅。 MT 理論認為呢啲變化會係非方向性同隨機位於代謝空間，而且傾向有高防禦價值嘅代謝物。以往對 OD 同 MT 預測嘅檢查都係用一組狹窄嘅先兆「防禦」化合物進行測試。呢啲以代謝物為中心嘅測試阻礙咗分析食草期間代謝組重新配置嘅程度同軌跡嘅能力，亦都唔容許喺一致嘅統計框架之內進行測試，需要關鍵嘅預測，可以整體考慮量化植物代謝組嘅變化。喺呢度，我哋用咗基於計算 MS 嘅代謝組學創新技術，並以資訊理論描述符嘅一般貨幣進行解卷積 MS 分析，嚟測試喺全球代謝組學層面上提出嘅兩者之間嘅區別。呢個理論嘅關鍵預測。資訊理論已經喺好多領域應用，特別係喺生物多樣性同營養流動研究嘅背景下（43）。但係，據我哋所知，呢個係第一個用嚟描述植物嘅代謝資訊空間同埋解決同環境訊號嘅暫時性代謝變化有關嘅生態問題嘅應用。特別係，呢個方法嘅能力在於佢可以比較植物物種內部同物種之間嘅模式，嚟檢查食草動物係點樣由唔同物種進化到唔同進化層面嘅物種間宏觀進化模式。新陳代謝。
主成分分析（ PCA ）係將多元數據集轉換成降維空間，噉樣就可以解釋數據嘅主要趨勢，所以佢通常用作解析數據集嘅探索性技術，例如解卷積代謝組。然而，降維會失去數據集中嘅部分資訊內容，而 PCA 唔能夠提供有關同生態理論特別相關嘅特徵嘅定量資訊，例如：食草動物點樣重新配置專門領域（例如豐富度、分佈同豐度）代謝物嘅多樣性？邊啲代謝物係特定食草動物嘅誘導狀態嘅預測因素？從特異性、多樣性同誘導性嘅角度，分解咗葉特異代謝物資料嘅資訊內容，發現食草動物可以激活特異代謝。估唔到，我哋觀察到，正如所實行嘅資訊理論指標所描述，兩種食草動物（夜食通才 Sl ）同茄科專家 Ms 嘅攻擊之後，所產生嘅代謝情況有好大嘅重疊。雖然佢哋嘅餵食行為同濃度有顯著差異。 OS 中脂肪酸 - 氨基酸結合物（ FAC ）引發劑（31）。透過用食草動物 OS 去治療標準化嘅穿刺傷口，模擬食草動物治療亦都顯示出類似嘅趨勢。呢個模擬植物對食草動物攻擊嘅反應嘅標準化程序，消除咗由食草動物嘅飲食行為變化所引起嘅混淆因素，而呢啲因素會喺唔同時間導致唔同程度嘅損傷（34）。已知係 OSM 嘅主要原因嘅 FAC 會減少 OSS1嘅 JAS 同其他植物荷爾蒙反應，而 OSS1就會減少幾百倍（31）。但係，同 OSM 相比， OSS1引起咗類似水平嘅 JA 累積。之前已經證明咗，衰弱嘅豬籠草嘅 JA 反應對 OSM 非常敏感，即使用水稀釋1:1000， FAC 都可以維持佢嘅活性（44）。所以，同 OSM 相比，雖然 OSS1嘅 FAC 好低，但係足以誘發足夠嘅 JA 爆發。以往嘅研究顯示，孔蛋白類蛋白（45）同寡糖（46）可以用作分子線索，觸發 OSS1嘅植物防禦反應。但係，仍然唔清楚 OSS1入面呢啲誘發因子係咪負責本研究所觀察到嘅 JA 累積。
雖然好少研究描述過應用唔同嘅食草動物或者外源 JA 或者 SA （水杨酸）所引起嘅差異代謝指紋（47），但係冇人擾動過植物草網絡中嘅食草動物物種特定擾動，同埋佢對特定代謝嘅整體影響嘅系統性研究。個人資料。呢個分析進一步證實，內部荷爾蒙網絡同除咗 JAs 之外嘅其他植物荷爾蒙嘅連結，會塑造食草動物引起嘅代謝重組嘅特異性。特別係，我哋檢測到由 OSM 引起嘅 ET 明顯大過由 OSS1引起嘅 ET 。呢個模式同 OSM 中更多 FAC 含量一致，呢個係觸發 ET 爆發嘅必要同充分條件（48）。喺植物同食草動物之間嘅相互作用嘅背景下， ET 對植物特異代謝物動力學嘅信號功能仍然係零星嘅，只係針對單一化合物群。另外，大部分研究都係用外源性應用 ET 或者佢嘅前體或者各種抑制劑去研究 ET 嘅調節，當中呢啲外源性嘅化學應用會產生好多非特異性嘅副作用。據我哋所知，呢項研究代表咗第一次大規模嘅系統性檢查 ET 喺利用 ET 生產同感知受損嘅轉基因植物嚟協調植物代謝組動態嘅作用。食草動物特異性 ET 誘導最終可以調節代謝組反應。最重要嘅係轉基因操縱 ET 生物合成（ ACO ）同感知（ ETR1）基因，揭示咗食草動物特異性嘅酚酰胺從頭累積。之前已經顯示出 ET 可以透過調節腐爛素 N- 甲基轉移酶嚟微調 JA 誘導嘅尼古丁累積（49）。但係，從機械角度睇，仲未清楚 ET 係點樣微調苯胺嘅誘導。除咗 ET 嘅信號轉導功能之外，代謝通量亦可以分流到 S- 腺苷 -1- 甲硫氨酸，以調節對多氨基酚酰胺嘅投資。 S- 腺苷 -1- 甲硫氨酸係 ET 同多胺生物合成途徑嘅常見中間體。 ET 信號調節酚酰胺水平嘅機制需要進一步研究。
好耐以嚟，由於大量結構未知嘅特殊代謝物，對特定代謝類別嘅強烈關注一直都係唔能夠嚴格評估生物相互作用後代謝多樣性嘅時間變化。目前，基於資訊理論分析，基於冇偏見代謝物嘅 MS/MS 光譜采集嘅主要結果係，食草動物食或者模擬食草動物會繼續降低葉代謝組嘅整體代謝多樣性，同時增加佢嘅專門化程度。呢種由食草動物引起嘅代謝組特異性嘅暫時性增加同轉錄組特異性嘅協同性增加有關。對呢個較大嘅代謝組專門化（有較高嘅 Si 值）有最大貢獻嘅特徵係具有之前表徵過嘅食草功能嘅特殊代謝物。呢個模型同 OD 理論嘅預測一致，但係同代謝組重編嘅隨機性有關嘅 MT 預測就唔一致。然而，呢個數據亦都同混合模型嘅預測一致（最佳 MT ；圖1B ），因為其他未表徵嘅代謝物，具有未知嘅防禦功能，仍然可能遵循隨機嘅 Si 分佈。
呢項研究進一步捕捉到嘅一個值得注意嘅模式係，由微進化層面（單一植物同煙草種群）到較大嘅進化規模（密切相關嘅煙草物種），唔同層面嘅進化組織都喺「最佳防禦」方面，食草動物嘅能力有顯著差異。摩爾等人。 （20）同 Kessler 同 Kalske （1）獨立提出將惠特克（50）原本區分嘅生物多樣性三個功能層面轉化為化學多樣性嘅構成性同誘導時間變化；呢啲作者都冇總結過大型代謝組數據收集嘅程序亦都冇概述過點樣根據呢啲數據計算代謝多樣性。喺呢個研究入面，對 Whittaker 嘅功能分類嘅細微調整會將 α- 代謝多樣性視為給定植物嘅 MS/MS 光譜多樣性，而 β- 代謝多樣性就係一群群體嘅基本種內代謝空間，而 γ- 代謝多樣性將會係類似物種分析嘅延伸。
JA 信號對廣泛嘅食草動物代謝反應係必要嘅。然而，缺乏對 JA 生物合成嘅種內調節對代謝組多樣性嘅貢獻嘅嚴格定量測試，而 JA 信號係咪喺更高嘅宏觀進化規模上係壓力誘導代謝多樣化嘅一般位點仍然係難以捉摸。我哋觀察到，食草豬瘟嘅食草性質會誘導代謝組專化，而尼古丁物種群體內同密切相關嘅尼古丁物種之間嘅代謝組專化嘅變化同 JA 信號傳導有系統性嘅正相關。另外，當 JA 信號受損嗰陣，由單一基因型食草動物誘導嘅代謝特異性就會被取消（圖3、 C 同 E ）。由於天然衰弱嘅豬籠草群體嘅代謝光譜變化大多係定量嘅，所以呢個分析中代謝 β 多樣性同特異性嘅變化可能好大程度上係由富含代謝物嘅化合物類別嘅強烈刺激引起。呢啲化合物類別係代謝組嘅一部分，並且導致同 JA 信號嘅正相關。
由於同佢有密切關係嘅煙草種嘅生化機制好唔同，所以代謝物係喺定性方面特別識別出嚟，所以係比較分析性嘅。資訊理論對捕捉到嘅代謝資料嘅處理顯示，食草誘導會加劇代謝伽馬多樣性同專門化之間嘅取捨。喺呢個取捨中， JA 訊號起到中心作用。代謝組專化嘅增加同主要嘅 OD 預測一致，同 JA 信號有正相關，而 JA 信號同代謝伽馬多樣性有負相關。呢啲模型表明植物嘅 OD 能力主要係由 JA 嘅可塑性決定，無論係喺微進化規模定係較大嘅進化規模。規避 JA 生物合成缺陷嘅外源性 JA 應用實驗進一步顯示，密切相關嘅煙草物種可以分為信號反應同信號非反應物種，就好似佢哋嘅 JA 模式同由食草動物誘導嘅代謝組可塑性一樣。信號冇反應嘅物種因為佢哋無法產生內源性 JA 而唔能夠作出反應，因此受到生理限制。呢個可能係由 JA 信號通路嘅某啲關鍵基因（ N. crescens 嘅 AOS 同 JAR4）嘅突變引起。呢個結果凸顯出呢啲物種間嘅宏觀進化模式可能主要係由內部荷爾蒙感知同反應嘅變化所驅動。
除咗植物同食草動物之間嘅相互作用之外，代謝多樣性嘅探索同生物適應環境同複雜表型特性嘅進化研究嘅所有重要理論進展有關。隨住現代 MS 儀器所獲得嘅數據量增加，對代謝多樣性嘅假設測試而家可以超越個體/類別代謝物差異，並進行全球分析，以揭示意想不到嘅模式。喺大規模分析嘅過程中，一個重要嘅比喻係構思出可以用嚟探索數據嘅有意義地圖嘅想法。所以，目前將無偏見 MS/MS 代謝學同資訊理論結合嘅重要結果係，佢提供咗一個簡單嘅指標，可以用嚟構建地圖，瀏覽唔同分類尺度嘅代謝多樣性。呢個係呢個方法嘅基本要求。微 / 宏觀進化同社區生態嘅研究。
喺宏觀進化層面， Ehrlich 同 Raven （51）嘅植物同昆蟲共同進化理論嘅核心係預測物種間代謝多樣性嘅變化係植物血統多樣化嘅原因。但係，喺呢本開創性嘅著作出版之後嘅五十年，呢個假設好少有人被測試（52）。呢個好大程度上係因為跨長途植物血統嘅可比代謝特徵嘅系統發育特徵。稀有度可以用嚟錨定目標分析方法。目前由資訊理論處理嘅 MS/MS 工作流程會量化未知代謝物嘅 MS/MS 結構相似性（冇事先選擇代謝物），並將呢啲 MS/MS 轉換成一組 MS/MS ，因此喺專業代謝中呢啲宏觀進化模型會喺分類規模上進行比較。簡單嘅統計指標。呢個過程同系統發育分析相似，可以用序列對齊去量化多樣化或者性格進化嘅速率，而唔使事先預測。
喺生化層面， Firn 同 Jones （53）嘅篩選假設顯示，代謝多樣性係維持喺唔同嘅層面，以提供原材料去發揮以前無關或者取代嘅代謝物嘅生物活性。資訊理論方法提供咗一個框架，可以將呢啲代謝物專化期間發生嘅代謝物特異進化轉變量化為所提出嘅進化篩選過程嘅一部分：由低特異性轉為高特異性嘅生物活性適應特定環境嘅受抑制代謝物。
總括嚟講，喺分子生物學嘅早期，重要嘅植物防禦理論被發展出嚟，而推斷假設驅動嘅方法被廣泛認為係科學進步嘅唯一手段。呢個好大程度上係因為測量整個代謝組嘅技術限制。雖然假設驅動方法喺選擇其他因果機制方面特別有用，但係佢哋對我哋對生化網絡嘅理解嘅能力比起當代數據密集型科學中目前可用嘅計算方法更加有限。所以，預測唔到嘅理論遠遠超出現有數據嘅範圍，所以研究領域嘅假設公式/測試週期進展係唔可以被廢除嘅（4）。我哋預見呢度介紹嘅代謝組學嘅計算工作流程可以重新點燃對代謝多樣性嘅最近（點樣）同最終（點解）問題嘅興趣，並且為理論引導嘅數據科學嘅新時代作出貢獻。呢個時代重新檢視咗啟發咗上一代嘅重要理論。
直接食草動物餵食係透過喺單一玫瑰開花植物嘅單一淡色投手植物葉上養第二階段幼蟲或者 Sl 幼蟲，每棵植物有10個植物複製品。昆蟲幼蟲用夾夾住，喺感染後24同72小時收集剩餘嘅葉組織，然後快速冷凍，然後提取代謝物。
以高度同步嘅方式模擬食草處理。方法係喺布花環嘅生長階段，用布紋輪喺植物三片完全擴張嘅葉嘅中肋兩邊穿刺三排刺，然後即刻搽1:5稀釋嘅女士或者用戴手套嘅手指將 S1 OS 插入穿刺傷口。如上所述收穫同加工一片葉子。用之前所講嘅方法去提取一次性代謝物同植物荷爾蒙（54）。
對於外源性 JA 應用，每種六種玫瑰開花植物嘅每棵嘅三個葉柄葉，用20 μ l 含有150 μ g MeJA （ Lan + MeJA ）嘅羊毛脂膏處理，同埋20 μ l 羊毛脂加傷口處理（ Lan + W ），或者用20 μ l 純羊毛脂作為對照。葉片喺處理後72小時收集，喺液氮中快速凍結，並喺 -80 °C 下儲存直至使用。
我哋嘅研究組已經鑑定咗四個 JA 同 ET 轉基因株，分別係 irAOC （36）、 irCOI1（55）、 irACO 同 sETR1（48）。 irAOC 強烈顯示出 JA 同 JA-Ile 水平嘅下降，而 irCOI1對 JAs 唔敏感。同 EV 相比， JA-Ile 嘅累積增加咗。同樣地， irACO 會減少 ET 嘅產生，而同 EV 相比，對 ET 唔敏感嘅 sETR1會增加 ET 嘅產生。
光聲激光光譜計（ Sensor Sense ETD-300實時 ET 感應器）係用嚟非侵入性噉進行 ET 測量。處理後立即切開一半葉，轉移至 4 毫升密封玻璃小瓶，並讓頭部空間於 5 小時內累積。喺測量過程中，每個小瓶都用每小時2升嘅純空氣流沖洗8分鐘，而呢啲空氣之前已經經過咗由 Sensor Sense 提供嘅催化劑去去除二氧化碳同水。
微陣列數據最初喺（35）發表，並儲存喺國家生物技術資訊中心（ NCBI ）基因表達綜合數據庫（存取號 GSE30287）。為咗呢個研究，我哋提取咗對應 W + OSMs 處理所引起嘅葉片同未受損對照嘅數據。原始強度係 log2。喺統計分析之前，用 R 軟件包將基線轉換同標準化到佢嘅第75個百分位數。
尼古丁物種嘅原始 RNA 測序（ RNA-seq ）數據係從 NCBI 短讀檔案館（ SRA ）擷取，項目編號係 PRJNA301787，係由周等人報告嘅。 （39）並按照（56）所述進行。本研究選擇對應尼古丁物種嘅 W + W 、 W + OSM 同 W + OSS1處理嘅原始數據進行分析，並以以下方式處理：首先，將原始 RNA-seq 讀數轉換為 FASTQ 格式。 HISAT2會將 FASTQ 轉換成 SAM ，而 SAMtools 就會將 SAM 檔案轉換成排序好嘅 BAM 檔案。 StringTie 係用嚟計算基因表達，而佢嘅表達方法係每千個鹼基片段就有一個片段，每百萬個已經測序嘅轉錄片段。
分析中所用嘅阿卡普色譜柱（150毫米 x 2.1毫米；粒徑2.2 μ m ）同4毫米 x 4毫米嘅保護柱由相同嘅材料組成。喺 Dionex UltiMate 3000超高性能液相色譜（ UHPLC ）系統中使用以下二元梯度：0至0.5分鐘，等度90 % A [去離子水，0.1 % （ v / v ）乙腈同0.05 % 甲酸（乙腈）； 0.5至23.5分鐘，梯度相分別係10 % A 同90 % B ； 23.5至25分鐘，等度10 % A 同90 % B 。流速係400 μ l / min 。對於所有 MS 分析，將柱洗脫液注入一個四極同飛行時間（ qTOF ）分析器，呢個分析器配備咗一個以正電離模式運作嘅電噴霧源（毛細管電壓，4500 V；毛細管出口130 V；乾燥溫度200 ° C ；乾燥氣流10升/分鐘）。
進行同數據無關或者無法區分嘅 MS / MS 片段分析（以下簡稱 MS / MS ），以獲得有關整體可檢測嘅代謝特徵嘅結構資訊。無差別 MS/MS 方法嘅概念係依賴四極有一個非常大嘅質量隔離窗口嘅事實［因此，將所有質量電荷比（ m / z ）訊號視為片段］。因此，由於 Impact II 儀器無法產生 CE 傾斜，因此使用增加嘅碰撞誘導解離碰撞能量（ CE ）值進行咗幾個獨立分析。總之，首先用 UHPLC- 電噴電離 / qTOF-MS 分析樣本，用單一質譜模式（由源內碎片化產生嘅低碎片化條件），以 5 Hz 嘅重複頻率由 m / z 50掃描到1500。用氮氣作為 MS/MS 分析嘅碰撞氣體，並喺以下四種唔同嘅碰撞誘導解離電壓下進行獨立測量：20、30、40同50 eV 。喺整個測量過程中，四極有最大嘅質量隔離窗口，由 m / z 50到1500。當前體 m/z 同隔離寬度實驗設定為200時，質量範圍會由儀器嘅操作軟件同0 Da 自動啟動。掃描質量片段，就好似喺單一質量模式噉。使用甲酸鈉（50毫升異丙醇、200微升甲酸同1毫升1M ​​NaOH 水溶液）進行質量校正。用 Bruker 嘅高精度校正算法，喺給定時間段內跑完平均頻譜之後，就會校正數據檔案。使用 Data Analysis v4.0軟件（德國不萊梅嘅 Brook Dalton ）嘅匯出功能，將原始數據檔案轉換成 NetCDF 格式。 MS/MS 數據集已經儲存喺開放嘅代謝組學資料庫 MetaboLights （ www . ebi . ac . uk ）入面，並且加入咗編號。 MTBLS1471。
MS/MS 組裝可以透過 MS1 同 MS/MS 質量訊號之間嘅相關分析，用嚟實現低同高碰撞能量同新實現嘅規則。 R 脚本係用嚟實現產品前體分布嘅相關分析，而 C # 脚本係用嚟實現規則。
為咗減少由背景噪音引起嘅假正誤差同埋只係喺幾個樣本中檢測到某啲 m/z 特徵所引起嘅假相關，我哋用咗 R 包 XCMS 嘅「填充峰」函數（用於背景噪音校正），應該用嚟取代「 NA 」（未檢測到嘅峰）強度。當使用填充峰函數時，數據集中仍然有好多「0」強度值會影響相關性計算。然後，我哋比較當使用填充峰函數同唔使用填充峰函數時所得嘅數據處理結果，並根據平均校正估計值計算背景噪音值，然後用計算出嚟嘅背景值取代呢 0 個強度值。我哋亦只係將強度超過佢哋嘅特徵視為「背景值嘅真實值」三次。對於 PCC 計算，只係考慮樣本前體（ MS1）嘅 m / z 信號同埋至少有八個真峰嘅片段數據集。
如果整個樣本中嘅前體質量特徵嘅強度同受到低或高碰撞能量嘅同一質量特徵嘅降低強度有顯著相關，而呢個特徵並冇被 CAMERA 標記為同位素峰，噉就可以進一步定義佢。然後，透過計算3秒內所有可能嘅前體 - 產物對（峰值保留嘅估計保留時間窗口），進行相關分析。只有當 m/z 值低過前體值，而 MS/MS 片段化發生喺同佢衍生出嚟嘅前體嘅數據集中相同嘅樣本位置嗰陣，先至算係片段。
基於呢兩個簡單嘅規則，我哋排除咗 m/z 值大過識別出嚟嘅前體嘅 m/z 嘅指定片段，同埋根據前體出現嘅樣本位置同指定片段。亦都可以選擇好多喺 MS1模式下產生嘅源內片段所產生嘅質量特徵作為候選前體，從而產生冗餘嘅 MS/MS 化合物。為咗減少呢個數據冗餘，如果光譜嘅 NDP 相似度超過0.6，而佢哋屬於 CAMERA 註解嘅色譜「 pcgroup 」，我哋會將佢哋合併。最後，我哋透過喺唔同碰撞能量下，喺所有具有相同 m / z 值嘅候選峰中選擇最高強度峰，將所有同前體同片段相關嘅四個 CE 結果合併成最終嘅解卷積複合光譜。之後嘅處理步驟係基於複合光譜嘅概念，並且考慮到最大化碎片化概率所需嘅唔同 CE 條件，因為有啲碎片只可以喺特定嘅碰撞能量下檢測到。
RDPI （30）係用嚟計算代謝特徵嘅誘導性。代謝光譜多樣性（ Hj 指數）係用 MS/MS 頻率分佈嘅香農熵，用 Martínez 等人所描述嘅以下方程式，由 MS/MS 前體嘅丰度推導出嚟。 （8）。 Hj = −∑i = 1mPijlog2（ Pij ），其中 Pij 對應第 j 個樣本中第 i 個 MS/MS 嘅相對頻率（ j = 1，2，⋯， m ）（ i = 1，2，⋯， m ） t ）。
代謝特異性（ Si 指數）係指給定 MS/MS 嘅表達同一性，相對於所考慮嘅樣本之間嘅頻率。 MS/MS 特異性計算為 Si = 1t （∑j = 1tPijPilog2PijPi）
用以下公式測量每個 j 個樣本嘅代謝組特異性 δj 指數，同埋 MS/MS 特異性嘅平均值 δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS 光譜係成對對齊，而相似度係根據兩個分數計算出嚟。首先，用標準 NDP （又稱余弦相關法），用以下方程式嚟評分光譜 NDP = （ ∑ iS1 & S2WS1， iWS2， i ）2∑ iWS1， i2 ∑ iWS2， i2之間嘅段相似性，其中 S1同 S2相應地，對於光譜1同光譜2，同埋基於 WS2、 i 同強度嘅差值嘅差異兩個光譜之間嘅第 i 個共同峰係小於0.01 Da 。權重嘅計算方法係： W = [ 峰值強度 ] m [ 質量 ] n ， m = 0.5， n = 2，正如大眾銀行所建議嘅咁。
實行咗第二種評分方法，涉及分析 MS/MS 之間嘅共享 NL 。為此，我哋並列使用咗 MS 碎片化過程中經常遇到嘅52個 NL 清單，同埋之前已經為弱化嘅豬瘟種嘅次級代謝物嘅 MS/MS 光譜註解過嘅更具體嘅 NL （資料檔案 S1）（9，26）。為每個 MS/MS 建立一個1同0嘅二進制向量，分別對應某啲 NL 嘅當前同唔存在。根據歐克里德距離相似度，計算每對二元 NL 向量嘅 NL 相似度得分。
為咗進行雙重聚類，我哋用咗 R 包 DiffCoEx ，呢個包係基於加權基因共表達分析（ WGCNA ）嘅擴展。我哋用 MS/MS 光譜嘅 NDP 同 NL 評分矩陣，用 DiffCoEx 嚟計算比較相關矩陣。二進制聚類係透過將「 cutreeDynamic 」參數設定為方法 = 「混合」、 cutHeight = 0.9999、深度分割 = T 同 minClusterSize = 10嚟進行。 DiffCoEx 嘅 R 源碼係由 Tesson 等人喺額外嘅檔案1下載。 （57）；所需嘅 R WGCNA 軟件包可以喺 https : / / horvath . 遺傳學 . ucla . edu/html/共表達網絡/R 包/WGCNA 搵到。
為咗進行 MS/MS 分子網絡分析，我哋根據 NDP 同 NL 相似類型計算咗配對光譜連接性，並用 Cytoscape 軟件喺 CyFilescape yFiles 布局算法擴展應用程式入面，用有機布局嚟可視化網絡拓扑。
使用 R 3.0.1版本對數據進行統計分析。統計顯著性係用雙向方差分析（ ANOVA ）嚟評估，然後用 Tukey 嘅誠實顯著差異（ HSD ）事後檢驗。為分析食草處理與對照之差異，採用 Student t 檢定分析兩組方差相同之樣本之雙尾分布。
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資訊理論為特殊代謝組嘅比較同測試防禦理論嘅預測提供咗一種通用嘅貨幣。
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