分泌途徑嘅蛋白質分類對於維持細胞隔間化同穩定係至關重要。除咗殼介導嘅分類之外，脂質喺分泌運輸過程中嘅動素分類中嘅作用係一個長期存在嘅基本問題，仲未有答案。喺呢度，我哋進行 3D 同時多色高分辨率實時成像，喺體內證明，新合成嘅糖基磷脂酰肌醇固定蛋白質，具有非常長嘅神經酰胺脂質部分，會聚集同分類成專門嘅內質網出口位置，呢個位置同跨膜蛋白質所用嘅唔同。另外，我哋表明內質網膜中嘅神經酰胺鏈長對呢種分類選擇性係至關重要。我哋嘅研究提供咗第一個直接嘅體內證據，可以根據脂質鏈長度將蛋白質貨物分類到分泌途徑嘅選擇性輸出位置。
喺真核細胞入面，內質網（ ER ）合成嘅蛋白質會喺運輸過程中經由分泌途徑進行分類，以便運送到佢哋適當嘅細胞目的地（1）。除咗外層介導嘅分類之外，長期以來一直推測某啲脂質亦都可以透過將佢哋聚集成特定蛋白質嘅特定膜網域，作為選擇性嘅出口點（2-5）。但係，仍然缺乏直接嘅體內證據去證明呢個可能嘅脂質機制。為咗解決呢個基本問題，我哋喺酵母中研究咗糖基磷脂酰肌醇（ GPI ）錨定蛋白（ GPI-APs ）係點樣由 ER 差異地輸出。 GPI-AP 係多種脂質連接嘅細胞表面蛋白質（6，7）。 GPI-AP 係一種分泌嘅蛋白質，透過糖脂部分（ GPI 錨）附着喺血漿膜嘅外單張。佢哋接受 GPI 錨作為 ER 腔嘅保守翻譯後修飾（8）。喺附著之後， GPI-AP 由 ER 經過高爾基體（5，9）去到血漿膜。 GPI 錨嘅存在會令 GPI-AP 沿分泌途徑同跨膜分泌蛋白（包括其他血漿膜蛋白）分開運輸（5、9、10）。喺酵母細胞入面， GPI-AP 會同內質網狀體入面嘅其他分泌蛋白質分離，然後包裝成由外層蛋白複合物 II （ COPII ）包裹嘅獨特囊泡（6，7）。 ER 輸出過程中呢個分類過程嘅決定因素係唔清楚嘅，但係有人推測呢個機制可能需要脂質，特別係 GPI 錨嘅脂質部分嘅結構重建（5，8）。喺酵母入面， GPI 脂質重塑係喺 GPI 附着之後即刻開始，而喺好多情況下，佢會令到神經酰胺同26碳長鏈飽和脂肪酸（ C26 : 0）結合（11，12）。 C26神經酰胺係酵母細胞到目前為止所產生嘅主要神經酰胺。佢係喺 ER 合成，而佢大部分都係透過 COPII 小泡輸出去高爾基體（13）。 GPI-AP 嘅 ER 輸出特別需要持續嘅神經酰胺合成（14，15），反過來，高爾基體中神經酰胺轉化為肌醇磷酸神經酰胺（ IPC ）係取決於 GPI 錨點合成（16）。用人造膜嘅生物物理研究顯示，非常長嘅酰基鏈陶瓷胺可以融合形成具有獨特物理性質嘅有序結構域（17，18）。呢啲資料導致假設，即係 C26陶瓷胺同 GPI-AP 同 C26陶瓷胺會利用佢哋嘅物理性質，喺相對亂嘅 ER 膜脂質環境中融合成有序嘅區域或者區域。佢主要係由短而唔飽和嘅甘油脂（ C16：1同 C18：1）組成（19，20）。呢啲區域會選擇性地集中喺特定嘅 ER 出口位置（ ERES ），喺呢個位置，神經酰胺同神經酰胺基 GPI-AP 可以喺同一個專用嘅 COPII 小泡中共同運送到高爾基體（5）。
喺呢個研究入面，我哋用咗超分辨率共焦實時成像顯微鏡（ SCLIM ）直接測試咗呢個基於脂質嘅機制，呢個係一種尖端嘅顯微鏡技術，可以同時觀察螢光標記嘅蛋白質。三色同三維（3D）圖像喺活細胞中具有極高嘅分辨率同速度（21，22）。
我哋首先應用咗 SCLIM 技術，進一步界定咗喺酒酵母中離開 ER 後，點樣喺跨膜分泌嘅蛋白質中篩選出帶有 C26神經酰胺基團嘅正常 GPI-AP 。為咗檢查 ER 嘅分類，我哋用咗一個遺傳系統，可以直接可視化新合成嘅貨物喺體內進入 ERES （7，23）。作為貨物，我哋選擇咗用綠色螢光蛋白（ GFP ）標記嘅 C26神經酰胺基 GPI-AP Gas1，同埋用近紅外線螢光蛋白（ iRFP ）標記嘅跨膜分泌蛋白 Mid2，兩者都針對血漿膜（24-26）。喺 sec31-1溫度敏感突變體入面，呢兩種貨物係喺半乳糖誘導啟動子同構成性 ERES 標記下表達。喺極端溫度（37 ° C ），由於 sec31-1突變會影響 COPII 外層成分 Sec31抑制 COPII 發芽同 ER 輸出嘅功能，所以新合成嘅貨物會喺 ER 累積（23）。喺冷卻到低溫（24 ° C ）之後， sec31-1突變細胞喺分泌區域恢復，而累積嘅新合成貨物開始由 ER 輸出。 CLIM 可視化顯示，大部分新合成嘅 Gas1-GFP 同 Mid2-iRFP 喺37 °C 溫育後仍然累積喺 sec31-1突變細胞嘅 ER ，然後喺24 °C 5分鐘釋放（圖1）。由於 Mid2-iRFP 分佈喺整個 ER 膜，而 Gas1-GFP 集中同聚集喺唔連續嘅 ER 膜區域，所以佢哋嘅分佈完全唔同（圖1， A 至 C 同電影 S1）。另外，如圖1D 所示， Gas1-GFP 叢集係冇 Mid2-iRFP 。呢啲結果表明 GPI-AP 同跨膜蛋白係早期分離成唔同嘅 ER 膜區域。 Gas1-GFP 叢集鄰近一個用 mCherry 嘅 COPII 外層蛋白 Sec13標記嘅特定 ERES （圖1、 E 同 F ，同埋電影 S1）（23）。
sec31-1細胞表達半乳糖誘導嘅分泌物，一條長嘅酰基鏈（ C26）神經酰胺 GPI-AP Gas1-GFP（ GPI-AP ，綠色）同跨膜蛋白 Mid2-iRFP（ TMP ，藍色），而呢個建構性 ERES 標記 Sec13-mCherry （ ERES ，移動到洋紅色）喺307分鐘內孵育24 ° C ，並喺5分鐘後用 SCLIM 成像。 （ A 至 C ）顯示咗一個平面嘅代表性合併或者單一2D 圖像（ A ）、10個 z 切片嘅2D投影圖像（B）或者貨物同 ERES 標記嘅3D 細胞半球圖像（ C ）。刻度棒 1 μ m （ A 同 B ）。刻度單位係0.551 μ m （ C ）。 Gas1-GFP 係喺離散嘅 ER 區域或者群集中檢測到，而 Mid2-iRFP 係檢測到並分佈喺整個 ER 膜（ C ）。 (D) 圖表顯示咗沿白色箭頭線（左）嘅 Gas1-GFP 叢集中 Gas1-GFP 同 Mid2-iRFP 嘅相對螢光強度。 AU ，任意單位。 （ E 同 F ）代表將貨物同 ERES 標記結合埋一齊嘅3D 圖像。喺特定嘅 ERES 附近檢測到 Gas1-GFP 叢集。刻度單位為 0.551 μ m 。 (F) 白色實線箭頭標記咗同 ERES 相關嘅 Gas1-GFP 叢集。中間同右邊嘅面板顯示咗合併咗嘅放大3D 圖像同埋所選 Gas1-GFP 叢集嘅旋轉視圖。
Gas1-GFP 叢同特定 ERES 之間嘅密切空間關係表明 Gas1-GFP 可以進入選擇性 ERES ，呢個同 Mid2-iRFP 用嚟離開 ER 嘅選擇性唔同。為咗解決呢個可能性，我哋只係量化咗一至兩種貨品嘅 ERES 比率（圖2， A 至 C ）。我哋發現大部分 ERES （70 % ）只係包含一種貨物。圖2C 嘅底部圖片顯示咗兩個典型嘅例子，係只有 Gas1-GFP （圖1）或者只有 Mid2-iRFP （圖2）嘅 ERES 。相反，大約20 % 嘅 ERES 包含兩個喺同一區域重疊嘅貨物。發現有啲 ERES （10 % ）含有兩種貨物，但係佢哋喺明顯唔同嘅地區隔離。因此，呢個統計分析顯示，喺 ER 輸出之後， GPI-AP Gas1-GFP 同跨膜貨物 Mid2-iRFP 會被分成唔同嘅 ERES （圖2D ）。呢個分類效率同之前嘅生化分析（6）同形態學決定（7）非常一致。我哋亦都可以觀察到隔離貨物進入 ERES 嘅行為（圖2E 同電影 S2）。圖2E 顯示，只有一小部分嘅 Gas1-GFP （圖3）或者 Mid2-iRFP（圖4）由一邊進入 ERES ，並且被局限喺一個離散嘅區域。圖2E嘅第5面板顯示， Gas1-GFP 同 Mid2-iRFP 有時會喺同一個 ERES 入面發現，但係佢哋由唔同嘅邊進入，並且集中喺可能代表唔同 COPII 小泡嘅唔同區域。我哋亦證實咗所觀察到嘅 C26神經酰胺基 GPI-AP Gas1嘅分離同分類為選擇性 ERES 係特異嘅，因為另一個跨膜分泌貨物，即 GFP 標記嘅血漿膜蛋白 Axl2（27），同 Mid2-iRFP 顯示出類似嘅行為。 （圖片 S1同電影 S3）。新合成嘅 Axl2-GFP 同 Mid2-iRFP 一樣透過 ER 膜分佈（圖 S1、 A 同 B ），同埋喺大部分 ERES 中同 Mid2-iRFP 共局部化（圖 S1、 B 至啲）。圖1嘅第1同2圖板。 S1C 顯示咗兩個典型嘅 ERES 例子，兩個跨膜貨物重疊。喺呢啲情況下，兩種貨品都會一齊進入 ERES （圖 S1E ，第3面板同電影 S3）。
將表達半乳糖誘導分泌物、 Gas1-GFP （ GPI-AP ，綠色）同 Mid2-iRFP（ TMP ，藍色）嘅 sec31-1細胞同埋構成性 ERES 標記嘅 Sec13-mCherry （ ERES ，洋紅色）放置喺37 °C 溫育30分鐘之後，用24 °C 釋放分泌物，然後移動到24 °C 嘅分泌物塊。 （ A 至 C ）貨物嘅代表性2D 投影圖像（ A ；比例尺，1 μ m ）或者3D細胞半球圖像（ B 同 C ；比例單位，0.456 μ m ）同埋用 ERES 標記嘅10個 z 斷面。 （ B ）嘅下方面板同（ C ）嘅面板顯示處理過嘅圖像，只顯示 ERES （洋紅色）中存在嘅貨品［ Gas1-GFP （灰色）同 Mid2-iRFP （淺藍色）］。 (C) 開放箭頭： ERES 只係載一件貨物（1至4）。灰色箭頭： ERES 包含隔離貨物（5）。白色實線箭頭：包含同一位置貨物嘅 ERES 。下面：所選單一 ERES 只含有氣體1-GFP（1）或中2-iRFP（2）。比例尺，100納米。 (D) （ C ）所述嘅顯微鏡圖嘅定量。只包含一種貨物（ Gas1-GFP 或 Mid2-iRFP ）、隔離貨物同重疊貨物嘅 ERES 嘅平均百分比。喺三個獨立嘅實驗中， n = 432喺54個細胞入面。錯誤欄 = SD 。雙尾未配對 t 檢驗。 *** P = 0.0002。 （ E ）用（ C ）標記嘅檢疫貨物嘅選定 ERES 嘅3D 圖像。 Gas1-GFP （綠色）（3）或者 Mid2-iRFP（藍色）（4）由一邊進入 ERES （洋紅色），並且只限於 ERES 內嘅一個小區域。有時，兩種貨物都會由同一邊進入同一個 ERES （5），並且被局限喺 ERES 內嘅一個隔離區域。比例尺，100納米。
接下來，我哋測試咗一個假設，即係 ER 膜中存在嘅長酰基鏈神經酰胺（ C26）會驅動 Gas1嘅特異聚類同分類成選擇性 ERES 。為此，我哋用咗一種改良嘅酵母菌株 GhLag1，其中兩種內源性神經酰胺合成酶 Lag1同 Lac1被 GhLag1（棉花嘅 Lag1同源物）取代，結果係一種酵母菌株嘅細胞膜神經酰胺菌株比野生型短（圖3A ）（28）。質譜（ MS ）分析顯示，喺野生型菌株中，95 % 嘅總神經酰胺係非常長（ C26）鏈神經酰胺，而喺 GhLag1中，85 % 嘅神經酰胺係非常長（ C18同 C16）。 ），只有2 % 嘅神經酰胺係好長（ C26）鏈嘅神經酰胺。雖然 C18同 C16神經酰胺係到目前為止喺 GhLag1膜中檢測到嘅主要神經酰胺，但 MS 分析亦證實咗喺 GhLag1菌株中表達嘅 Gas1-GFP 嘅 GPI 錨含有 C26神經酰胺，呢個係同野生型脂質相當。質素係一樣嘅（圖3A ）（26）。所以，呢個意思係神經酰胺重建酶 Cwh43對 C26神經酰胺有高度選擇性，如圖26所示，佢優先納入咗 GhLag1菌株中少量 C26神經酰胺嘅 GPI 錨點。 S2（29）。不過， GhLag1嘅細胞膜基本上只係含有 C18-C16神經酰胺，而 Gas1-GFP 仍然有 C26神經酰胺。呢個事實令到呢個菌株成為一個理想嘅工具，用嚟專門解決 ER 中膜神經酰胺嘅酰基鏈長度問題。班級同排序嘅假設作用。然後，我哋首先透過傳統嘅螢光顯微鏡研究咗 C26 Gas1-GFP 喺 GhLag1中以 sec31-1嘅溫度敏感突變等位基因成群聚集嘅能力，當中只有長（ C18-C16）鏈存在於 ER 膜神經酰胺中（圖3）。我哋觀察到喺 sec31-1中，大部分嘅 Gas1-GFP 都集中喺成簇，而喺有長（ C18-C16）長神經酰胺 ER 膜嘅 sec31-1 GhLag1中嘅 Gas1-GFP 主要係冇聚集喺整個 ER 膜中。準確嚟講，由於基於 C26神經酰胺嘅聚類同特定嘅 ERES 有密切關係（圖1），我哋接下來就研究咗呢個過程係咪亦可能涉及到 ER 輸出蛋白機制嘅功能。 GPI-AP 用咗一個特殊嘅 COPII 系統嚟輸出 ER ，呢個系統係由 Ted1對 GPI 錨嘅聚糖部分嘅結構重建積極調節（30，31）。然後重組 GPI- 聚糖會被跨膜貨物受體 p24複合體識別，而呢個複合體反過來會選擇性噉招募 Lst1，呢個係主要 COPII 貨物結合亞基 Sec24嘅特定同型，形成富含 GPI-AP 嘅 COPII 小泡係必要嘅（31-33）。所以，我哋構建咗一個雙突變體，將呢啲單一蛋白質（ p24複合物成分 Emp24、 GPI- 聚糖重建酶 Ted1同特定嘅 COPII 亞基 Lst1）嘅缺失同 sec31-1突變株結合，並研究佢哋係咪有可能形成 Gas1叢集 GFP （圖3）。我哋觀察到喺秒31-1emp24Δ同秒31-1ted1Δ中， Gas1-GFP 主要係冇聚集嘅，並且分佈喺整個 ER 膜，正如之前喺秒31-1 GhLag1中所見，而喺秒31-1lst1Δ中， Gas1-GFP 同第31-1一樣。呢啲結果表明，除咗 ER 膜入面存在 C26神經酰胺之外， Gas1-GFP 嘅聚類亦都需要同 p24複合物結合，而且唔需要特定嘅 Lst1招募。然後，我哋探討咗 ER 膜中神經酰胺嘅鏈長可以調節 Gas1-GFP 同 p24嘅結合嘅可能性。然而，我哋發現膜中存在 C18-C16神經酰胺並唔會影響 p24複合物重建嘅 GPI- 聚糖（圖 S3同 S4， A 同 B ），或者同 GPI-AP 結合同輸出 GPI-AP 。能力。招募 COPII 亞型 Lst1（圖 S4C ）。所以， C26神經酰胺依賴聚類唔需要蛋白質同唔同嘅 ER 輸出蛋白質機制相互作用，而係支持由脂質長度驅動嘅替代分類機制。然後，我哋分析咗 ER 膜入面嘅神經酰胺酰基鏈長度對於有效將 Gas1-GFP 分類為選擇性 ERES 係咪重要。由於帶有短鏈神經酰胺嘅 GhLag1菌株中嘅 Gas1會離開 ER 並進入血漿膜（圖 S5），我哋相信如果分類係由神經酰胺酰基鏈嘅長度驅動，噉 GhLag1菌株中嘅 Gas1就可以重新定向同交叉。 ERES 貨品同膜一樣。
（ A ） GhLag1嘅細胞膜主要含有較短嘅 C18-C16神經酰胺，而 Gas1-GFP 嘅 GPI 錨仍然有同野生型細胞相同嘅 C26 IPC 。上圖：用質譜法（ MS ）分析野生型（ Wt ）同 GhLag1p 菌株細胞膜中嘅神經酰胺嘅酰基鏈長度。呢啲數據代表咗總神經酰胺嘅百分比。三個獨立實驗嘅平均值。錯誤欄 = SD 。雙尾未配對 t 檢驗。 **** P < 0.0001。底圖：對野生型同 GhLag1p 菌株表達嘅 Gas1-GFP （ GPI-IPC ） GPI 錨點中存在嘅 IPC 嘅酰基鏈長度進行 MS 分析。數據代表總 IPC 訊號嘅百分比。五個獨立實驗嘅平均值。錯誤欄 = SD 。雙尾未配對 t 檢驗。 ns ，唔重要。 P = 0.9134。 （ B ）表達半乳糖誘導嘅 Gas1-GFP 嘅秒31-1、秒31-1 GhLag1、秒31-1emp24 Δ 、秒31-1ted1Δ同秒31-1lst1Δ細胞嘅螢光顯微鏡圖，喺37 °C 下溫育30 °C 形成螢光素20分鐘後，並傳遞到微量4。白色箭頭： ER 氣體1-GFP 叢集。開放箭頭：未聚集嘅 Gas1-GFP 分佈喺整個 ER 膜上，顯示出 ER 特徵嘅核環染色。刻度棒，5 μ m 。 (C) 喺（ B ）所述嘅顯微鏡照片嘅定量。有點狀 Gas1-GFP 結構嘅細胞嘅平均百分比。喺三個獨立嘅實驗中， n ≥ 300個細胞。錯誤欄 = SD 。雙尾未配對 t 檢驗。 **** P < 0.0001。
為咗直接解決呢個問題，我哋用 sec31-1溫度敏感突變等位基因喺 GhLag1中對 Gas1-GFP 同 Mid2-iRFP 進行 SCLIM 可視化（圖4同電影 S4）。 ER 喺37 °C 保留，隨後喺24 °C 釋放之後，大部分新合成嘅 Gas1-GFP 都冇聚集同分佈喺整個 ER 膜，正如傳統顯微鏡所觀察到嘅（圖4、 A 同 B ）。另外，好大比例嘅 ERES （67 % ）包括兩種貨物同時喺佢入面（圖4D ）。圖4C嘅1同2圖板顯示咗兩個典型嘅 ERES 例子，佢哋有重疊嘅 Gas1-GFP 同 Mid2-GFP 。另外，兩種貨品都被招募到同一個 ERES （圖4E，面板3同電影 S4）。因此，我哋嘅結果表明， ER 膜中嘅神經酰胺酰基鏈長度係 ER 蛋白質聚集同分類嘅重要決定因素。
表達半乳糖誘導分泌物、 Gas1-GFP （ GPI-AP ，綠色）同 Mid2-iRFP （ TMP ，藍色）嘅 Sec31-1 GhLag1細胞同埋構成性 ERES 標記嘅 Sec13-mCherry （ ERES ，洋紅色）喺37 °C 下孵育。持續30分鐘，降到24℃釋放分泌物，20分鐘後用 SCLIM 成像。 （ A 至 C ）由貨物同 ERES 標記嘅10個 z 斷面嘅代表性2D 投影圖像（ A ；比例尺，1 μ m ）或者3D 細胞半球圖像（ B 同 C ；比例單位，0.45 μ m ）。 （ B ）嘅下方面板同（ C ）嘅面板顯示處理過嘅圖像，只顯示 ERES （洋紅色）中存在嘅貨品［ Gas1-GFP （灰色）同 Mid2-iRFP （淺藍色）］。 （ C ）白色填充箭頭： ERES ，貨物重疊。打開箭頭： ERES 只包含一個項目。下圖：所選 ERES 有重疊嘅貨物（1同2），標示喺（ C ）。比例尺，100納米。 (D) （ C ）所述嘅顯微鏡圖嘅定量。喺第31-1同第31-1 GhLag1單位入面，只係包括一個貨物（ Gas1-GFP 或者 Mid2-iRFP ），同埋隔離貨物同重疊貨物嘅平均 ERES 百分比。喺三個獨立嘅實驗中， n = 432喺54個細胞（秒31-1）同 n = 430喺47個細胞（秒31-1 GhLag1）。錯誤欄 = SD 。雙尾未配對 t 檢驗。 *** P = 0.0002（秒31-1）同** P = 0.0031（秒31-1 GhLag1）。 (E) 喺（ C ）標記咗有重疊貨物（3）嘅選定 ERES 嘅3D 圖像。 Gas1-GFP （綠色）同 Mid2-iRFP （藍色）由同一邊接近 ERES （洋紅色），並停留喺同一個 ERES 禁區。比例尺，100納米。
呢項研究提供咗直接嘅體內證據，證明脂質基蛋白質貨物被分類到分泌途徑嘅選擇性輸出位點，並且揭示咗酰基鏈長度對分類選擇性嘅重要性。我哋用咗一種強大而尖端嘅顯微鏡技術，叫做 SCLIM ，喺酵母中展示咗新合成嘅 Gas1-GFP （一種主要嘅血漿膜 GPI-AP ，有一條非常長嘅酰基鏈（ C26）神經酰胺脂質部分）。另外，呢兩種貨品會選擇性噉進入唔同嘅 ERES （圖2）。膜中細胞神經酰胺嘅酰基鏈長度由 C26縮短到 C18-C16， Gas1-GFP 簇被破壞到離散嘅 ER 區域，而 Gas1-GFP 被重新路由，透過相同嘅 ERES 離開 ER 同跨膜蛋白（圖3同圖3）。 4）。
雖然 GPI-AP 用一個專門嘅蛋白質機制去離開 ER ，但我哋發現 C26神經酰胺依賴性分離唔依賴可能導致 ERES 專化嘅差異蛋白質相互作用（圖 S4同 S5）。相反，我哋嘅研究結果支持一個由基於脂質嘅蛋白質聚類同隨後排除其他貨物所驅動嘅替代分類機制。我哋嘅觀察顯示，同特定 ERES 相關嘅 Gas1-GFP 區域或者叢集缺乏跨膜分泌蛋白 Mid2-iRFP ，呢個表明 C26神經酰胺依賴性 GPI-AP 叢集會促進佢哋進入相關嘅 ERES ，同時，排除跨膜分泌物進入呢個特定嘅 ERES （圖1同2）。相反 , ER 膜中存在 C18-C16陶瓷胺唔會令 GPI-AP 形成區域或叢集，所以佢哋唔會排除或取代跨膜分泌嘅蛋白質進入同一個 ERES ( 圖3同4 ) 。 。因此，我哋提出 C26神經酰胺通過促進同特定 ERES 相關嘅蛋白質嘅聚類嚟驅動分離同分類。
點樣去實現呢個依賴 C26神經酰胺嘅聚類到特定嘅 ER 區域？膜神經酰胺橫向分離嘅傾向可能會令 GPI-AP 同 C26神經酰胺喺含有較短同唔飽和甘油脂嘅 ER 膜嘅較唔規則嘅脂質環境中形成細小同瞬間有序嘅脂質。質量集群（17、18）。呢啲小型嘅暫時性叢集喺同 p24複合物結合之後可以進一步融合成更大、更穩定嘅叢集（34）。同呢個一致，我哋表明 C26 Gas1-GFP 需要同 p24複合物相互作用，以形成更大嘅可見叢集（圖3）。 p24複合物係由酵母中四種唔同嘅 p24跨膜蛋白組成嘅雜合低聚物（35），佢提供多价結合，可以導致小型 GPI-AP 簇嘅交聯，從而產生更大嘅穩定簇（34）。 GPI-AP 嘅蛋白質外域之間嘅相互作用亦可能有助於佢哋嘅聚集，就好似佢哋喺哺乳動物極化上皮細胞嘅高爾基體運輸過程中所示（36）。但係，當 C18-C16神經酰胺存在於 ER 膜中，當 p24複合物同 Gas1-GFP 結合嗰陣，就唔會形成大型嘅獨立簇。底層機制可能取決於長酰基鏈神經酰胺嘅特定物理同化學性質。人造膜嘅生物物理研究顯示，雖然長（ C24）同短（ C18-C16）酰基鏈神經酰胺都可以引起相分離，但係只有長酰基鏈神經酰胺（ C24）可以促進高曲率同膜彎曲，以重塑膜。透過互相參考（17、37、38）。已經顯示出 TMED2嘅跨膜螺旋，即係 Emp24嘅人類同源物，會選擇性噉同細胞質小孔嘅 C18神經酰胺基鞘磷脂相互作用（39）。我哋用分子動力學（ MD ）模擬，發現 C18同 C26神經酰胺都會喺 Emp24跨膜螺旋嘅細胞質小葉周圍累積，而且佢哋嘅偏好相似（圖 S6）。值得注意嘅係，呢個表明 Emp24嘅跨膜螺旋可以導致膜中脂質嘅非對稱分佈。呢個係基於哺乳動物細胞嘅最近結果。類似嘅 MD 模擬亦都顯示出醚脂質嘅存在（40）。所以，我哋推測 ER26兩個小葉入面嘅 C26神經酰胺係局部富集嘅。當腔小孔中嘅 GPI-AP 直接同多价 p24結合，而 C26神經酰胺喺細胞質小孔中 p24周圍嘅累積，就可以促進隨附嘅蛋白質聚集，並且透過手指產生膜曲率（41），令 GPI-AP 分離成鄰近 ERES 嘅離散膜區域（亦都係有利於 ERES 4）嘅高度曲線區域。先前嘅報告支持呢個提議嘅機制（43，44）。寡凝集素、病原體或抗體同神經酰胺基糖鞘脂（ GSL ）喺血漿膜上嘅多价結合會觸發大量 GSL 聚集，增強相分離，並引起膜變形同內化（44）。 Iwabuchi 等（43）發現喺存在長（ C24）但唔係短（ C16）酰基鏈嘅情況下，同 GSL 乳糖神經酰胺結合嘅多价配體會誘導大簇嘅形成同膜內陷，而小葉上嘅細胞質 Lyn 介導嘅信號轉導係由嗜中性球偶聯嘅。
喺哺乳動物極化上皮細胞中，抗高爾基體網絡（ TGN ）嘅濃度到頂端血漿膜嘅水平會控制 GPI-AP 嘅分離同分類（10，45）。呢種聚集係由 GPI-AP 低聚化驅動（36），但係佢亦都可能取決於我哋喺酵母入面發現嘅神經酰胺鏈長度。雖然哺乳動物 GPI-AP 有醚脂質基錨，而且佢嘅化學結構同非常長嘅酰基鏈神經酰胺好唔同，但係最近嘅研究發現兩種脂質嘅物理同化學性質同功能進化上都好相似（40）。所以，哺乳動物細胞入面嘅醚脂質部分可能同酵母入面嘅 C26神經酰胺相似，而佢嘅作用係同膜入面嘅長鏈神經酰胺結合，促進 GPI-AP 嘅聚集同分選。雖然呢個可能性仍然需要直接測試，但係之前嘅研究結果支持長酰基鏈神經酰胺嘅運輸到高爾基體唔係由細胞質轉移蛋白進行，而係取決於酵母之類嘅 GPI 錨嘅合成。因此，進化保守機制似乎能夠喺同一個運輸小泡中選擇性地共運輸非常長嘅酰基鏈神經酰胺同 GPI-AP （13、16、20、46、47）。
喺酵母同哺乳動物嘅極化上皮細胞系統入面， GPI-AP 嘅聚集同同其他血漿膜蛋白嘅分離都係喺到達細胞表面之前發生。帕拉迪諾等人。 （48）發現喺哺乳動物極化上皮細胞嘅 TGN 上， GPI-AP 聚類唔單止係 GPI-APs 選擇性分類到頂端血漿膜嘅必要條件，亦都調節 GPI-APs 嘅聚類組織同埋佢嘅生物活性。細胞表面。喺酵母中，呢項研究顯示 ER 上嘅 C26神經酰胺依賴性 GPI-AP 叢集可以調節血漿膜上 GPI-AP 嘅叢集組織同功能活性（24，49）。同呢個模型一致， GhLag1細胞對 GPI 抑制劑或者影響細胞壁完整性嘅藥物過敏（28），而酵母細胞交配中投射嘅尖端神經酰胺嘅功能性 Gas1-GFP 簇（49）嘅需要表明 GhLag1細胞可能會產生生理後果。 GPI-AP 錯誤。然而，進一步測試細胞表面嘅功能組織係咪已經透過基於脂質長度嘅分類方法由 ER 編程出嚟，將會係我哋未來研究嘅主題。
本研究所用嘅酒酵母菌株列喺表 S1。喺 W303嘅背景下構建咗用於活細胞成像嘅 SCLIM 嘅 MMY1583同 MMY1635菌株。呢啲表達有螢光蛋白標籤嘅 Sec13-mCherry 嘅菌株係用聚合酶連鎖反應（ PCR ）嘅方法構建，以 pFA6a 質粒為模板（23）。喺 GAL1啟動子嘅控制下，表達用螢光蛋白標記嘅 Mid2-iRFP 嘅菌株構建如下。從 pKTiRFP-KAN 輸送體中進行 iRFP-KanMx 序列嘅 PCR 擴增（ E . O ' Shea 嘅禮物，阿德基因質粒編號64687； http : / / n2t . net / addgene ：64687；研究資源識別碼（ RRID ）：阿德基因 _ 64687），並插入內源性 Mid2 嘅 C 末端。將 Mid2-iRFP 基因組序列擴增並克隆到 GAL1啟動子之後，就整合到整合質粒 pRS306嘅 Not I-Sac I 位點。所得質粒 pRGS7用 Pst I 線性化，整合到 URA3基因座。
Gas1-GFP 融合基因係喺着絲粒（ CEN ）質粒中嘅 GAL1啟動子嘅控制下表達，而呢個質粒嘅構建如下。將 Gas1-GFP 序列由 pRS416-GAS1-GFP 質粒（24）（ L . Popolo 嘅禮物）（ L . Popolo 嘅禮物）進行 PCR 擴增，然後克隆到 CEN 質粒 pBEVY-GL LEU2嘅 Xma I-Xho I 位點（ C 嘅禮物）。米勒；附加基因質粒編號51225； 51225； RRID ：添加基因 _ 51225）。所得嘅質粒被命名為 pRGS6。 Axl2-GFP 融合基因亦都係喺 pBEVY-GL LEU2輸送體嘅 GAL1啟動子嘅控制下表達，而佢嘅構建如下。由 pRS304-p2HSE-Axl2-GFP 質粒（23）通過 PCR 擴增 Axl2-GFP 序列，並克隆到 pBEVY-GL LEU2載體嘅 Bam HI-Pst I 位點。所得嘅質粒被命名為 pRGS12。本研究所用嘅寡核苷酸嘅序列列喺表 S2。
菌株加入0.2 % 腺嘌呤同2 % 葡萄糖［ YP- 葡萄糖（ YPD ）］，2 % 拉菲糖［YP-拉菲糖］富含酵母提取物蛋白 p （ YP ）培養基（1 % 酵母提取物同2 % 蛋白質 ept ）。 （ YPR ）］或者2 % 半乳糖［YP- 半乳糖（ YPG ）］作為碳來源，或者喺合成基本培養基（0.15 % 酵母氮碱同0.5 % 硫酸銨）中補充營養所需嘅適當氨基酸同碱，同埋含有2 % 葡萄糖（合成葡萄糖最低培養基）或者2 % 半乳糖碳來源。
為咗實時成像，喺 GAL1啟動子下表達構建體嘅溫度敏感嘅 sec31-1突變細胞喺24 °C 嘅 YPR 培養基中生長過夜至對數中期。喺24 °C 嘅 YPG 中誘導1個鐘之後，將細胞喺37 °C 嘅 SG 中滲透30分鐘，然後轉移到24 °C 釋放分泌塊。康卡納瓦林 A 係用嚟將細胞固定喺玻璃片上面，並用 SCLIM 成像。 SCLIM 係奧林巴斯 IX-71倒置螢光顯微鏡同 UPlanSApo 100 × 1.4數值光圈油鏡頭（奧林巴斯）、高速同高信噪比旋轉盤共焦掃描器（橫川電機）、定制光譜計同定制散熱器嘅組合鏡頭系統，最終放大倍率係 × 266.7，同埋一個可以乘以電子嘅電荷耦合裝置相機（濱松光子）（21）。圖像采集係由自訂軟件（橫川電機）進行。對於3D影像，我哋用咗個訂造嘅壓電致動器垂直振動物鏡，然後將相隔100納米嘅光學部件收集成一堆。將 Z-stack 圖像轉換成3D 像素數據，而旋轉盤共焦顯微鏡所用嘅理論點擴散函數用 Volocity 軟件（ PerkinElmer ）進行解卷積處理。透過使用 Volocity 軟件自動關口進行同位置分析，測量咗包括貨物嘅 ERES 。線掃描分析係用 MetaMorph 軟件（分子裝置）進行。
使用 GraphPad Prism 軟件來確定統計顯著性。對於雙尾學生 t 檢驗同普通單向方差分析（ ANOVA ）檢驗，組別之間嘅差異被認為對 P <0.05（ * ）有顯著影響。
對於 Gas1-GFP 嘅螢光顯微鏡檢查，將對數相細胞喺 YPD 中生長過夜，然後用離心法收集，用磷酸鹽緩衝鹽水洗淨兩次，然後喺冰上孵育至少15分鐘，然後按照之前嘅方法喺顯微鏡下進行檢查（24）。採用咗配備物鏡、 L5（ GFP ）濾鏡、濱松相機同應用套件 X （ LAS X ）軟件嘅勞卡 DMi8顯微鏡（ HCX PL APO 1003/1.40油 PH3 CS ）進行采集。 。
將樣本用 SDS 樣本緩衝液喺65 °C 變性10分鐘，然後用 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE ）分離。免疫印迹分析時，每條車道載入10 μl 樣本。一抗：用兔多克隆抗 Gas1以1:3000稀釋，兔多克隆抗Emp24以1:500稀釋，兔多克隆抗 GFP （由 H. Riezman 贈送）以1:3000稀釋。小鼠單克隆抗 Pgk1抗體係用1:5000嘅稀釋度（ J . de la Cruz 嘅禮物）。二抗：辣根過氧化物酶（ HRP ）結合山羊抗兔免疫球蛋白 G （ IgG ），稀釋 1:3000使用（皮爾斯）。使用 HRP 結合山羊抗小鼠 IgG ，稀釋 1:3000（皮爾斯）。免疫反應區係用超級信號西皮科試劑（熱費爾科學）嘅化學發光法觀察到嘅。
如（31）所述，對富集嘅 ER 組分進行天然免疫沉澱實驗。總之，用 TNE 緩衝液［50 mM tris-HCl （ pH 7.5）、150 mM NaCl 、5 mM EDTA 、1 mM 苯甲基磺酰氟同蛋白酶抑制劑混合物）喺600 nm （ OD600 ）以100光學密度洗兩次酵母細胞。佢用玻璃珠打破，然後用離心去除細胞碎片同玻璃珠。然後將上清液喺4 °C 下以17，000克離心15分鐘。將顆粒重懸浮於 TNE 中，並加入洋地黃皂苷，最終濃度為 1 % 。將懸濁液於 4 °C 下旋轉滲透 1 小時，然後於 4 °C 下以 13,000 g 离心 60 分鐘，除去不溶成分。對於 Gas1-GFP 免疫沉澱，首先將樣本用空瓊脂糖珠（ ChromoTek ）喺 4 ° C 下預先溫育 1 小時，然後用 GFP-Trap _ A （ ChromoTek ）喺 4 ° C 溫育 3 小時。免疫沉澱嘅珠用含有0.2 % 地高辛嘅 TNE 洗淨5次，用 SDS 樣本緩衝液洗脫，喺 SDS-PAGE 上分離，然後用免疫印迹分析。
如（31）所述，對富集嘅 ER 組分進行交聯測定。簡單嚟講，將富集嘅 ER 組分用0.5 mM 二硫代二（丙酸琥珀酰亞胺基）（皮爾斯，熱費爾科學公司，羅克福德，伊利諾伊州，美國；20 ° C ，20分鐘）溫育。加入甘氨酸（50 mM 最終濃度，5分鐘，20 ° C ）淬滅交聯反應。
如之前所講（50），對野生型同 GhLag1菌株嘅神經酰胺進行咗 MS 分析。總之，細胞喺30 °C 嘅 YPD 中生長到指數期（3至4個 OD600單位/毫升），然後收集25 × 107個細胞。佢哋嘅新陳代謝係用三氯乙酸熄滅。使用萃取溶劑［乙醇、水、醚、吡啶及4.2 N 氫氧化銨（15:15:5:1:0.018 v/v）］同1.2 nmol 內部標準 C17陶瓷胺（860517， Avanti 極性脂質）質素）。用單甲胺試劑［甲醇、水、正丁醇和甲胺溶液（4：3：1：5 v / v ）］對萃取物進行溫和嘅鹼性水解，然後用水飽和嘅正丁醇脫鹽。最後，將萃取物重懸浮於正模式溶劑［氯仿/甲醇/水（2:7:1） + 5 mM 乙酸銨］中，並注入質譜計。進行多反應監測（ MRM ）嚟驗證同定量鞘脂分子。 TSQ Vantage 三級四極質譜計（熱費爾科學）配備咗一個機械人納米流離子源 Nanomate HD （ Advion Biosciences ，伊薩卡，紐約），用嚟進行脂質分析。碰撞能量係針對每個神經酰胺類別進行優化。 MS 數據係以正模式得到。對於每個生物複製，脂質信號係三個獨立測量嘅中位數。
如（31）所述，表達 Gas1-GFP 嘅細胞（800 × 107）經過自然免疫沉澱。純化咗嘅 Gas1-GFP 用 SDS-PAGE 分離，然後轉移到聚偏二氟乙烯（ PVDF ）膜上。蛋白質係透過用酰胺黑染色 PVDF 嚟可視化。將 Gas1-GFP 帶由 PVDF 切開，並用甲醇洗淨 5 次，用液相色譜 MS （ LC-MS ）級水洗淨 1 次。透過將膜條用500 μ l 0.3 M NaOAc （ pH 4.0）、緩衝液同500 μ l 新鮮溶解嘅1 M 亞硝酸鈉混合物喺37 °C 下溫育3個鐘，脂質組分會由 Gas1-GFP 同裂解後嘅肌苷磷酸神經酰胺（神經酰胺）釋放。之後，用 LC-MS 級水洗淨膜條 4 次，室溫乾燥，並於 -80 °C 氮氣氛下儲存至分析。作為對照，每個實驗都用咗一個空白嘅 PVDF 膜樣本。然後，按照所述，用 MS 分析由 Gas1-GFP 提取嘅脂質（50）。總之，將含有 GPI- 脂質嘅 PVDF 條重懸浮喺75 μ l 負模具溶劑［氯仿/甲醇（1:2） + 5 mM 乙酸銨］中，並通過電噴電離（ ESI ） -MRM/MS 鞘脂物種分析（ TSQ Vantage ）。喺呢個情況下， MS 數據係喺負離子模式下得到。
如前面所講， GPI 錨嘅脂質部分係同 [3H] - 肌醇標記嘅 GPI-AP 分離出嚟嘅（16）。使用溶劑系統（55:45:10氯仿 - 甲醇 -0.25 % KCl ）進行薄層色譜分離脂質，並使用 FLA-7000（富士膜）可視化。
表達 Gas1-GFP （600 × 107）嘅細胞用 TNE 緩衝液同 TNE 緩衝液洗淨兩次，並用玻璃珠破碎，然後離心去除細胞碎片同玻璃珠。然後將上清液喺4 °C 下以17，000克離心1小時。將顆粒用 TNE 洗淨，然後用 1 U PI-PLC （ Invitrogen ）喺含有0.2 %洋地黃皂苷嘅 TNE 中喺37 °C 下溫育1小時。酶處理後，喺4 °C 下以17，000 g 離心1小時去除膜。為咗免疫沉澱 Gas1-GFP ，將上清液同 GFP-Trap _ A （ ChromoTek ）喺4 °C 下溫育過夜。用 SDS-PAGE 分離嘅純化咗嘅 Gas1-GFP 用庫馬西閃藍染色。將 Gas1-GFP 染色帶從水管周圍嘅灰色切開，然後用碘乙酰胺烷基化同二硫三醇還原後，用胰蛋白酶進行凝膠內消化。提取同乾燥胰蛋白酶肽同埋含有 GPI- 聚糖嘅肽。將乾燥嘅肽溶解喺20 μl 水中。將一部分（8 μ l ）注入 LC 。喺特定嘅梯度條件下，用咗十八烷基硅烷（ ODS ）柱（ Develosil 300ODS-HG-5；內徑150毫米 × 1.0毫米；日本愛知縣野村化學）分離肽。流動相係溶劑 A （0.08 % 甲酸）同溶劑 B （0.15 % 甲酸喺80 % 乙腈中）。我哋用咗 Accela HPLC 系統（馬薩諸塞州波士頓嘅熱費舍科學公司），喺55分鐘內用溶劑 A 洗脫柱，以50 μl min-1嘅流速洗脫柱5分鐘，然後將溶劑 B 嘅濃度增加到40 % 。 ，美國）。將洗脫液持續引入 ESI 離子源，並用 LTQ Orbitrap XL （混合線性離子陷阱 - 軌道陷阱質譜計；熱費爾科學）分析胰蛋白酶肽同帶有 GPI- 聚糖嘅肽。喺 MS 設置中，毛細管源嘅電壓設定為4.5 kV ，而轉移毛細管嘅溫度保持喺300 ° C 。毛細管電壓同管鏡片電壓分別設定為15 V 同50 V 。 MS 數據係喺300/m/z 質量/電荷比（m/z）3000嘅質量範圍內以正離子模式（分辨率為60，000；質量準確度為百萬分之10）得到。 MS/MS 數據係透過 LTQ Orbitrap XL 嘅離子陷阱得到。
MD 模擬係用 GROMACS （52）軟件同 MARTINI 2力場（53-55）進行。然後用 CHARMM GUI 膜建立器（56，57）構建含有二油酰磷脂酰膽鹼（ DOPC ）同 Cer C18或者 DOPC 同 C26嘅双層。 Cer C26嘅拓撲同座標係由 DXCE 推導出嚟，方法係喺鞘氨酸尾部移除額外嘅珠子。用下面所講嘅過程去平衡雙層同埋執行佢，然後用系統嘅最後一個座標去建立一個包含 Emp24嘅系統。酵母 Emp24嘅跨膜結構域（殘基173至193）係用視覺 MD （ VMD ）工具分子結構構建成 α - 螺旋（58）。然後，喺去除重疊嘅脂質之後，將蛋白質粗粒化，然後用 CHARMM GUI 插入双層。最終嘅系統包含1202個 DOPC 同302個 C26或者1197個 DOPC 同295個 C18同 Emp24。將個系統電離到0.150M 嘅濃度。對兩種双層組合物進行咗四個獨立嘅複製。
脂質双層係用 CHARMM GUI 過程去平衡，呢個過程包括將405，000個步驟減至最低，然後平衡，喺呢個過程入面，位置约束會逐漸減少同消除，而時間步驟由0.005 ps 增加到0.02 ps 。平衡之後，佢會產生6 μ s ，時間步長係0.02 ps 。插入 Emp24之後，用相同嘅 CHARMM GUI 過程去最小化同平衡個系統，然後喺生產過程中運行8秒。
對於所有系統，喺平衡過程中，壓力係由 Berendsen 氣壓器（59）控制，而喺生產過程中，壓力係由 Parrinello-Rahman 氣壓器（60）控制。喺所有情況下，平均壓力都係1 bar，並且使用半各向同性壓力耦合方案。喺平衡同生產過程中，一個具有速度重新校正嘅恆溫器（61）係用嚟分別耦合蛋白質、脂質同溶劑顆粒嘅溫度。喺整個運作期間，目標溫度係310K。非結合相互作用係透過使用 0.005緩衝公差嘅 Verlet 方案生成配對清單嚟計算。庫倫項係用反應場同1.1 nm 嘅截止距離計算出嚟。 Vander Waals 項使用截止方案，截止距離為 1.1 nm ，而 Verlet 截止方案用於電位漂移（62）。
用 VMD ， DOPC 磷酸鹽珠或者神經酰胺 AM1珠同蛋白質之間嘅截止波長係0.7 nm ，然後計算出同蛋白質相互作用嘅脂質數量。根據以下公式，計算耗盡富集（ DE ）因子，如（63）： DE 因子 = （蛋白質中嘅總脂質量0.7）喺蛋白質0.7（總脂質中嘅 Cer 量）
報告嘅值係以平均值嘅形式得到，而誤差條係 SE 嘅四個獨立副本。 DE 因子嘅統計顯著性係用 t 檢驗 [ （平均 DE 因子 -1）/SE ］計算出嚟。由單尾分佈計算 P 值。
用 GROMACS 工具計算含有 Emp24嘅系統嘅二維橫向密度圖，係喺軌跡嘅最後250 ns 內。為咗得到神經酰胺嘅富集/耗盡圖，將 Cer 嘅密度圖除以 Cer 同 DOPC 嘅圖之和，然後除以體內嘅 Cer 濃度。用咗同一個顏色地圖比例。
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索菲亞 · 羅德里格斯 - 加拉多，黑川和夫，蘇珊娜 · 薩比多 - 博佐，亞歷杭德羅 · 科特斯 · 戈麥斯（亞歷杭德羅 · 科爾特斯 - 戈麥斯），池田敦子（池田敦子），瓦萊莉亞 · 佐尼（瓦萊里亞 · 佐尼），塞利亞洛佩茲）、和加美穗（和賀美穗）、阿曼美佐子（阿曼美佐子）、里曼宮子（宮子里曼）、普羅明、斯特凡諾 · 范妮、中野秋彦、曼努爾 · 穆尼茲
3D 高分辨率實時成像揭示咗神經酰胺鏈長度對選擇性輸出位點嘅蛋白質分類嘅重要性。
索菲亞 · 羅德里格斯 - 加拉多，黑川和夫，蘇珊娜 · 薩比多 - 博佐，亞歷杭德羅 · 科特斯 · 戈麥斯（亞歷杭德羅 · 科爾特斯 - 戈麥斯），池田敦子（池田敦子），瓦萊莉亞 · 佐尼（瓦萊里亞 · 佐尼），塞利亞洛佩茲）、和加美穗（和賀美穗）、阿曼美佐子（阿曼美佐子）、里曼宮子（宮子里曼）、普羅明、斯特凡諾 · 范妮、中野秋彦、曼努爾 · 穆尼茲
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©2020美國科學進步協會。保留所有權利。 AAAS 係 HINARI 、 AGORA 、 OARE 、合唱、 CLOCKSS 、 CrossRef 同 COUNTER 嘅合作夥伴。科學進步 ISSN2375-2548。