免疫調節代謝物係腫瘤微環境（ TME ）嘅一個關鍵特徵，但除咗少數例外，佢哋嘅身份仍然係未知之數。喺呢度，我哋分析咗高等級血清性癌（ HGSC ）患者嘅腫瘤同腹水嘅腫瘤同 T 細胞，嚟揭示呢啲唔同嘅 TME 隔間嘅代謝組。腹水同腫瘤細胞有廣泛嘅代謝物差異。同腹水相比，腫瘤浸潤嘅 T 細胞係顯著富集1-甲基煙酰胺（ MNA ）。雖然 T 細胞嘅 MNA 水平升高，但係尼古丁酰胺 N- 甲基轉移酶（一種催化甲基由 S- 腺酰甲硫氨酸轉移到尼古丁酰胺嘅酶）嘅表達只限於成纖維細胞同腫瘤細胞。功能上， MNA 會誘導 T 細胞分泌促腫瘤細胞因子腫瘤壞死因子 α 。因此， TME 衍生嘅 MNA 有助於 T 細胞嘅免疫調節，並且代表咗一個潛在嘅免疫療法靶點，用嚟治療人類癌症。
腫瘤衍生嘅代謝物可以對抗腫瘤免疫有深遠嘅抑制作用，而且越嚟越多嘅證據顯示佢哋亦都可以作為疾病進展嘅關鍵驅動力（1）。除咗 Warburg 效應之外，最近嘅研究已經開始表徵腫瘤細胞嘅代謝狀態同埋佢同腫瘤微環境（ TME ）嘅免疫狀態嘅關係。對小鼠模型同人類 T 細胞嘅研究顯示，谷氨酰胺代謝（2）、氧化代謝（3）同葡萄糖代謝（4）可以獨立對唔同嘅免疫細胞亞群作用。呢啲途徑入面嘅幾種代謝物會抑制 T 細胞嘅抗腫瘤功能。已經證明咗，阻斷輔酶四氫生物蝶呤（ BH4）會損害 T 細胞嘅增殖，而體內 BH4嘅增加可以增強由 CD4同 CD8介導嘅抗腫瘤免疫反應。另外，犬尿氨酸嘅免疫抑制作用可以透過施用 BH4嚟拯救（5）。喺异檸檬酸脫氫酶（ IDH ）突變型神經膠質母細胞瘤中，對映體代謝（ R ） -2- 羥基谷氨酸（ R-2-HG ）嘅分泌會抑制 T 細胞嘅活化、增殖同細胞溶解活性（ 6 ）。最近，有研究顯示，甲基乙二醛，係糖酵解嘅副產物，係由骨髓來源嘅抑制細胞產生，而甲基乙二醛嘅 T 細胞轉移可以抑制效因子 T 細胞功能。喺治療中，甲基乙二醛嘅中和可以克服骨髓衍生抑制細胞（ MDSC ）嘅活性，並且喺小鼠模型中協同增強檢查點阻斷療法（7）。呢啲研究集體強調咗 TME 衍生代謝物喺調節 T 細胞功能同活性嘅關鍵作用。
卵巢癌中嘅 T 細胞功能障礙已經被廣泛報告（8）。呢個部分係因為缺氧同異常嘅腫瘤血管系統固有嘅代謝特性（9），導致葡萄糖同色氨酸轉化為副產物，例如乳酸同犬尿氨酸。過量嘅細胞外乳酸會減少干擾素 - γ （ IFN- γ ）嘅產生，並且驅動骨髓抑制亞群嘅分化（10，11）。食色氨酸會直接抑制 T 細胞增殖同埋抑制 T 細胞受體信號傳導（12-14）。儘管有呢啲觀察，但係好多圍繞免疫代謝嘅工作都係用優化培養基喺體外 T 細胞培養中進行，或者只係限於體內嘅同源小鼠模型，兩者都冇完全反映人類癌症同生理宏觀同微觀環境嘅異質性。
卵巢癌嘅一個常見特徵係腹膜擴散同腹水嘅出現。腹水中細胞液嘅積累同晚期疾病同預後差有關（15）。據報導，呢個獨特嘅隔間係缺氧嘅，有高水平嘅血管內皮生長因子（ VEGF ）同吲哚胺2，3-二加氧酶（ IDO ），並且被 T 調節細胞同骨髓抑制細胞滲透（15-18）。腹水嘅代謝環境可能同腫瘤本身唔同，所以腹膜空間嘅 T 細胞重新編程係唔清楚嘅。此外，腫瘤環境中存在嘅腹水同代謝物之間嘅關鍵差異同異質性可能會阻礙免疫細胞嘅滲透同埋佢哋喺腫瘤上嘅功能，需要進一步研究。
為咗解決呢啲問題，我哋設計咗一種敏感嘅細胞分離同液相色譜串聯質譜（ LC-MS / MS ）方法，用嚟研究唔同嘅細胞類型（包括 CD4 + 同 CD8 + T 細胞），同埋腫瘤內同腫瘤之間嘅代謝物，跨越病人同一個腹水同腫瘤環境嘅細胞。我哋用呢個方法同高維流式細胞術同單細胞 RNA 測序（ scRNA-seq ）一齊用嚟提供呢啲關鍵群體嘅代謝狀態嘅高度分辨率肖像。呢個方法顯示腫瘤 T 細胞中1-甲基尼古丁酰胺（ MNA ）水平明顯增加，而體外實驗顯示， MNA 對 T 細胞功能嘅免疫調節作用係以前未知嘅。一般嚟講，呢個方法可以揭示腫瘤同免疫細胞之間嘅相互代謝相互作用，同埋提供對免疫調節代謝物嘅獨特見解，呢個可能對治療基於 T 細胞嘅卵巢癌免疫療法有用嘅治療機會。
我哋用咗高維流式細胞術嚟同時量化葡萄糖攝取［2- （ N- （7-硝基苯基 -2- 氧 -1，3- 二氮 -4- 基）氨基） -2- 脫氧葡萄糖（2-NBDG）同線粒體活性［MitoTracker Deep Red（ MT DR ）］（7，19，可以分辨細胞群體 T 嘅典型標記）（7，19，同邊20嘅細胞係典型嘅 T 標記） S2同圖 S1A ）。呢個分析顯示，同 T 細胞相比，腹水同腫瘤細胞嘅葡萄糖攝取水平較高，但係線粒體活性嘅差異較小。腫瘤細胞［ CD45-EpCAM （ EpCAM ） + ］嘅平均葡萄糖攝取係 T 細胞嘅三至四倍，而 CD4 + T 細胞嘅平均葡萄糖攝取係 CD8 + T 細胞嘅1.2倍，呢個表明腫瘤浸潤淋巴細胞（ TIL ）即使喺同一個 TME 都有唔同嘅代謝需求（圖1A ）。相反，腫瘤細胞嘅線粒體活性同 CD4 + T 細胞相似，而兩種細胞類型嘅線粒體活性都高過 CD8 + T 細胞（圖1B ）。一般嚟講，呢啲結果顯示咗代謝水平。腫瘤細胞嘅代謝活性高於 CD4 + T 細胞，而 CD4 + T 細胞嘅代謝活性高於 CD8 + T 細胞。儘管跨細胞類型有呢啲影響，但係同腫瘤相比， CD4 + 同 CD8 + T 細胞嘅代謝狀態或者佢哋喺腹水嘅相對比例並冇一致嘅差異（圖1C ）。相反，喺 CD45細胞組分中，同腹水相比，腫瘤中嘅 EpCAM + 細胞比例增加（圖1D ）。我哋亦都觀察到 EpCAM + 同 EpCAM- 細胞成分之間有明顯嘅代謝差異。 EpCAM + （腫瘤）細胞嘅葡萄糖攝取同線粒體活性比 EpCAM- 細胞高，比起 TME 嘅腫瘤細胞成纖維體嘅代謝活性高好多（圖1、 E 同 F ）。
（ A 同 B ）葡萄糖攝取（2-NBDG）（ A ）同 CD4 + T 細胞嘅線粒體活性（ MitoTracker 深紅色）嘅中位數螢光強度（ MFI ）（ B ）代表性圖表（左）同表格數據（右），腹水同腫瘤嘅 CD8 + T 細胞同 EpCAM + CD45腫瘤細胞。 (C) 腹水同腫瘤中 CD4 + 同 CD8 + 細胞（ CD3 + T 細胞）嘅比例。 （ D ）腹水同腫瘤中 EpCAM + 腫瘤細胞嘅比例（ CD45 − ）。 （ E 同 F ） EpCAM + CD45腫瘤同 EpCAM-CD45基質葡萄糖攝取（2-NBDG）（E）同線粒體活性（ MitoTracker 深紅色）（ F ）代表性圖表（左）同表格數據（右）腹水同腫瘤細胞。 (G) 流式細胞術嘅 CD25、 CD137同 PD1表達嘅代表性圖表。 （ H 同 I ） CD4 + T 細胞（ H ）同 CD8 + T 細胞（ I ）上嘅 CD25、 CD137同 PD1嘅表達。 （ J 同 K ）基於 CCR7同 CD45RO 嘅表達嘅天真、中央記憶（ Tcm ）、效因子（ Teff ）同效因子記憶（ Tem ）表型。腹水同腫瘤嘅 CD4 + T 細胞（ J ）同 CD8 + T 細胞（ K ）嘅代表性圖像（左）同表格數據（右）。由配對 t 檢驗（ * P < 0.05， * * P < 0.01同 * * * P < 0.001）決定嘅 P 值。條線代表匹配嘅病人（ n = 6）。 FMO ，螢光減一； MFI ，螢光強度中位數。
進一步嘅分析顯示，高度分辨嘅 T 細胞表型狀態之間有其他顯著差異。腫瘤中嘅活化（圖1， G 至 I ）同效因子記憶（圖1， J 同 K ）比腹水（ CD3 + T 細胞嘅比例）頻繁得多。同樣地，透過活化標記（ CD25同 CD137）同耗盡標記［程式化細胞死亡蛋白1（ PD1）］嘅表達嚟分析表型，發現雖然呢啲群體嘅代謝特徵唔同（圖 S1、 B 至 E ），但係喺天真、效因子或記憶亞群之間並冇一致觀察到顯著嘅代謝差異（圖 S1、 F 至 I ）。呢啲結果係透過機器學習方法自動分配細胞表型而得到證實（21），進一步顯示患者腹水中存在大量骨髓細胞（ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ）（圖 S2A ）。喺所有識別出嚟嘅細胞類型當中，呢個骨髓細胞群顯示出最高嘅葡萄糖攝取同線粒體活性（圖 S2， B 至 G ）。呢啲結果突顯咗 HGSC 患者腹水同腫瘤中發現嘅多種細胞類型之間嘅強烈代謝差異。
理解 TIL 嘅代謝特性嘅主要挑戰係需要喺腫瘤中分離出足夠純度、質量同數量嘅 T 細胞樣本。最近嘅研究顯示，基於流式細胞術嘅分類同珠富集方法可能會導致細胞代謝物資料嘅變化（22-24）。為咗克服呢個問題，我哋優化咗珠富集方法，喺用 LC-MS/MS 分析之前，將 TIL 從手術切除嘅人卵巢癌中分離同分離出嚟（睇材料同方法；圖2A ）。為咗評估呢個方案對代謝物變化嘅整體影響，我哋將上述珠分離步驟後由健康捐贈者激活嘅 T 細胞同未分離珠但仍然喺冰上嘅細胞進行比較。呢個質量控制分析發現呢兩個條件之間有高度相關（ r = 0.77），而86種代謝物組嘅技術重複性有高重複性（圖2B ）。所以，呢啲方法可以喺經歷緊細胞型富集嘅細胞中進行準確嘅代謝物分析，從而提供咗第一個高分辨率平台去識別 HGSC 中嘅特定代謝物，從而令人對細胞特異性嘅性代謝計劃有更深入嘅認識。
(A) 磁珠富集示意圖。喺用 LC-MS/MS 分析之前，細胞會連續經歷三輪磁珠富集，或者留喺冰上。 (B) 富集類型對代謝物豐度嘅影響。每種富集類型嘅三次測量嘅平均值 ± SE 。灰色線代表1:1嘅關係。軸標籤所示嘅重複測量嘅班內相關性（ ICC ）。 NAD ，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。 (C) 患者代謝物分析工作流程示意圖。腹水或腫瘤係喺病人身上收集，然後冷凍保存。每個樣本嘅一小部分都係用流式細胞測定法分析，而其餘嘅樣本就經過三輪 CD4 + 、 CD8 + 同 CD45- 細胞嘅富集。呢啲細胞組分係用 LC-MS/MS 分析。 (D) 標準化代謝物丰度嘅熱圖。樹狀圖代表沃德對樣本之間嘅歐幾里得距離嘅聚類。 （ E ）樣本代謝物圖嘅主成分分析（ PCA ），顯示每個樣本嘅三次重複，同一個病人嘅樣本係用一條線連接。 (F) 以病人為條件嘅樣本代謝物資料嘅 PCA ( 即係用部分冗餘 ) ;樣本類型受到凸船體嘅限制。 PC1，主要組件1； PC2，主要組件 2 。
接下來，我哋應用呢個富集方法，分析咗6名 HGSC 患者嘅原發性腹水同腫瘤嘅 CD4 + 、 CD8 + 同 CD45細胞組分中嘅99種代謝物（圖2C 、圖 S3A 同表 S3同 S4）。感興趣嘅群體佔原始大量活細胞樣本嘅2 % 至70 % ，而細胞嘅比例喺患者之間有好大嘅差異。分離珠子之後，平均嚟講，富集嘅目標部分（ CD4 + 、 CD8 + 或 CD45- ）佔樣本中所有活細胞嘅超過85 % 。呢個富集方法令我哋可以分析人體腫瘤組織代謝嘅細胞群，而呢個係喺大型樣本中係唔可能做到嘅。用呢個方案，我哋確定咗 l- 犬尿氨酸同腺苷，呢兩種特徵良好嘅免疫抑制代謝物，喺腫瘤 T 細胞或者腫瘤細胞中升高（圖 S3、 B 同 C ）。所以，呢啲結果證明咗我哋嘅細胞分離同質譜技術喺病人組織中搵到生物學上重要嘅代謝物嘅忠實性同能力。
我哋嘅分析亦都顯示咗患者內部同患者之間嘅細胞類型有強烈嘅代謝分離（圖2D 同圖 S4A ）。特別係，同其他患者相比，患者70顯示出唔同嘅代謝特徵（圖2E 同圖 S4B ），表明患者之間可能存在相當大嘅代謝異質性。值得注意嘅係，同其他患者（1.2至2升；表 S1）相比，70名患者（80毫升）所收集嘅腹水總量較少。主要成分分析期間對患者間異質性嘅控制（例如，使用部分冗餘分析）顯示細胞類型之間嘅一致變化，而細胞類型同/或微環境係根據代謝物分佈清楚聚集（圖2F ）。單一代謝物嘅分析強調咗呢啲效應，並且顯示咗細胞類型同微環境之間嘅顯著差異。值得注意嘅係，觀察到最極端嘅差異係 MNA ，佢通常喺 CD45- 細胞同埋滲透腫瘤嘅 CD4 + 同 CD8 + 細胞中富集（圖3A ）。對於 CD4 + 細胞嚟講，呢個效果係最明顯，而 CD8 + 細胞入面嘅 MNA 亦都似乎受到環境嘅強烈影響。不過，呢個唔重要，因為六個病人當中只有三個可以評估腫瘤 CD8 + 評分。除咗 MNA 之外，喺腹水同腫瘤嘅唔同類型細胞入面，其他喺 TIL 中表現唔好嘅代謝物亦都係差異性豐富（圖 S3同 S4）。所以，呢啲數據揭示咗一套有前途嘅免疫調節代謝物，供進一步研究。
(A) 腹水同腫瘤嘅 CD4 + 、 CD8 + 同 CD45- 細胞中 MNA 嘅正常化含量。箱形圖顯示中位數（線）、四分位數間範圍（框架鉸鏈）同數據範圍，最多係四分位數間範圍（框架晶鬚）嘅1.5倍。如病人材料同方法所述，用病人嘅臨界值嚟確定 P 值（ * P < 0.05同 ** P < 0.01）。 (B) MNA 代謝示意圖（60）。代謝物： S- 腺苷 -1- 甲硫氨酸； SAH ， S- 腺苷 -1- 同型半胱氨酸； NA ，尼古丁酰胺； MNA ，1-甲基煙酰胺； 2-PY,1- 甲基 -2- 吡啶酮 -5- 甲酰胺； 4-PY,1- 甲基 -4- 吡啶酮 -5- 羧酰胺； NR ，尼古丁酰胺核糖； NMN ，煙酰胺單核苷酸。酶（綠色）： NNMT ，煙酰胺 N- 甲基轉移酶； SIRT ， Sirtuins ； NAMPT ，煙酰胺磷酸核糖基轉移酶； AOX1，醛氧化酶1； NRK ，煙酰胺核苷激酶； NMNAT ，尼古丁酰胺單核苷酸腺苷酸轉移酶； Pnp1，嘌呤核苷磷酸化酶。 （ C ）腹水（灰色）同腫瘤（紅色； n = 3個患者）嘅 scRNA-seq 嘅 t-SNE 。 （ D ）用 scRNA-seq 驗證嘅唔同細胞群中嘅 NNMT 表達。 （ E ） NNMT 同 AOX1喺 SK-OV-3、人胚胎腎（ HEK ）293T 、 T 細胞同 MNA 處理過嘅 T 細胞中嘅表達。摺疊嘅表達係相對於 SK-OV-3顯示嘅。顯示咗用 SEM 嘅表達模式（ n = 6個健康捐贈者）。 Ct 值大過35會被視為檢測唔到（ UD ）。 （ F ）用8mM MNA 處理嘅 SK-OV-3、 HEK293T 、 T 細胞同 T 細胞中 SLC22A1同 SLC22A2嘅表達。摺疊嘅表達係相對於 SK-OV-3顯示嘅。顯示咗用 SEM 嘅表達模式（ n = 6個健康捐贈者）。 Ct 值大過35會被視為檢測唔到（ UD ）。 （ G ）用 MNA 溫育72小時後，活化嘅健康供體 T 細胞中嘅細胞 MNA 含量。顯示咗用 SEM 嘅表達模式（ n = 4個健康捐贈者）。
MNA 係由煙酰胺 N- 甲基轉移酶（ NNMT ；圖3B ）將甲基由 S- 腺苷 -1- 甲硫氨酸（ SAM ）轉移到尼古丁酰胺（ NA ）而產生。 NNMT 係多種人類癌症中過度表達，同增殖、侵襲同轉移有關（25-27）。為咗更好咁理解 TME 嘅 T 細胞中 MNA 嘅來源，我哋用 scRNA-seq 嚟表徵三位 HGSC 患者嘅腹水同腫瘤中跨細胞類型嘅 NNMT 表達（表 S5）。對大約6，500個細胞嘅分析顯示，喺腹水同腫瘤環境下， NNMT 嘅表達只限於推定嘅成纖維細胞同腫瘤細胞群（圖3、 C 同啲）。值得注意嘅係，喺任何表達 PTPRC （ CD45 + ）嘅群體中都冇明顯嘅 NNMT 表達（圖3D 同圖 S5A ），表明喺代謝物光譜中檢測到嘅 MNA 已經被引入 T 細胞。醛氧化酶1（ AOX1）嘅表達會將 MNA 轉化為1-甲基-2-吡啶酮-5-羧酰胺（2-PYR）或1-甲基-4-吡啶酮-5-羧酰胺（4- PYR）；圖3B）亦都限於表達 COL1A1嘅成纖維細胞群體（圖 S5A ），呢啲一齊表明 T 細胞缺乏傳統 MNA 代謝嘅能力。呢啲 MNA 相關基因嘅表達模式係用第二個獨立細胞數據集嚟驗證，呢個數據集係嚟自 HGSC 患者嘅腹水（圖 S5B ； n = 6）（16）。此外，對用 MNA 處理嘅健康捐贈者 T 細胞進行定量聚合酶連鎖反應（ qPCR ）分析，發現同對照 SK-OV-3卵巢腫瘤細胞相比， NNMT 或 AOX1幾乎冇表達（圖3E ）。呢啲意想不到嘅結果表明， MNA 可能會由成纖維細胞或者腫瘤分泌到 TME 嘅鄰近 T 細胞入面。
雖然候選物包括由可溶性載體22（ SLC22）家族（ SLC22A1、 SLC22A2同 SLC22A3）編碼嘅有機陽離子輸送體1至3家族（ OCT1、 OCT2同 OCT3），但係 MNA 嘅潛在輸送體仍然未定義（28）。健康捐贈者 T 細胞嘅 mRNA 嘅 QPCR 顯示 SLC22A1嘅表達水平低，但係 SLC22A2嘅表達水平係檢測唔到，呢個證實咗之前喺文獻入面有報導過（圖3F ）（29）。相反， SK-OV-3卵巢腫瘤細胞系表達咗高水平嘅兩種輸送體（圖3F ）。
為咗測試 T 細胞有冇能力吸收外來 MNA ，健康嘅捐贈者 T 細胞喺唔同濃度嘅 MNA 存在下培養咗72個鐘。喺冇外源性 MNA 嘅情況下，係檢測唔到 MNA 嘅細胞含量（圖3G ）。然而，用外源性 MNA 處理嘅活化 T 細胞顯示出細胞中 MNA 含量嘅劑量依賴性增加，高達 6 mM MNA （圖3G ）。呢個結果表明，儘管輸送體表達水平低，同埋缺乏負責細胞內 MNA 代謝嘅主要酶， TIL 仍然可以攝取 MNA 。
患者 T 細胞嘅代謝物光譜同體外 MNA 吸收實驗增加咗癌症相關成纖維體（ CAF ）分泌 MNA 嘅可能性，而腫瘤細胞可能會調節 TIL 嘅表型同功能。為咗確定 MNA 對 T 細胞嘅影響，喺有或冇 MNA 嘅情況下，喺體外激活健康嘅供體 T 細胞，並評估佢哋嘅增殖同細胞因子嘅產生。以最高劑量加入 MNA 7 日後，人口倍增數適度降低，而所有劑量都保持活力（圖4A ）。此外，外源性 MNA 嘅治療導致表達腫瘤壞死因子 - α （ TNF α ；圖4B ）嘅 CD4 + 同 CD8 + T 細胞嘅比例增加。相反，細胞內 IFN-γ 嘅產生喺 CD4 + T 細胞中顯著降低，但係喺 CD8 + T 細胞中就冇，而白細胞介素2（ IL-2；圖4、 C 同啲）亦冇顯著變化。因此，呢啲 MNA 處理過嘅 T 細胞培養物嘅上清液嘅酶聯免疫吸附測定（ ELISA ）顯示 TNF α 明顯增加， IFN- γ 減少，而 IL-2冇變化（圖4， E 至 G ）。 。 IFN-γ 嘅降低表明 MNA 可能會喺抑制 T 細胞嘅抗腫瘤活性方面發揮作用。為咗模擬 MNA 對 T 細胞介導嘅細胞毒性嘅影響，針對由綠色螢光蛋白（ GFP ） -CAR-T ）細胞調節嘅葉酸受體 α 同 CAR-T （ GFP ）嘅嵌合抗原受體 T （ FR α -CAR-T ）細胞係由健康捐贈者外周血單核細胞（ PBMC ）產生。將 CAR-T 細胞喺 MNA 嘅存在下培養24小時，然後同表達參酸受體 α 嘅人 SK-OV-3卵巢腫瘤細胞以10:1嘅效因子同靶比例共培養。 MNA 處理導致 FRα-CAR-T 細胞嘅殺傷活性顯著下降，呢個同用腺苷處理嘅 FRα-CAR-T 細胞相似（圖4H ）。
（ A ）喺第7日直接嚟自培養嘅總活細胞數量同群體翻倍（ PD ）。條形圖代表六個健康捐贈者嘅平均值 + SEM 。代表至少 n = 3個獨立實驗嘅數據。 （ B 至啲） CD3/ CD28同 IL-2係用嚟喺佢哋各自嘅 MNA 濃度下激活 T 細胞，持續7日。分析前，用 PMA/离子霉素同 GolgiStop 刺激細胞4個鐘。 T 細胞中嘅 TNF α （ B ）表達。活細胞中 TNFα 表達嘅例子圖像（左）同表格數據（右）。喺 T 細胞中嘅 IFN-γ （ C ）同 IL-2（ D ）表達。細胞因子嘅表達係用流式細胞術測量。棒形圖代表平均值（ n = 6個健康捐贈者） + SEM 。用單向方差分析同重複測量（ * P < 0.05同 * * P < 0.01）嚟確定 P 值。代表至少 n = 3個獨立實驗嘅數據。 （ E 至 G ） CD3/ CD28同 IL-2係用嚟喺佢哋各自嘅 MNA 濃度下激活 T 細胞，持續7日。喺 PMA / 離子霉素刺激4個鐘之前同之後收集培養基。用 ELISA 測量 TNF α （ E ）、 IFN- γ （ F ）同 IL-2（ G ）嘅濃度。棒形圖代表平均值（ n = 5個健康捐贈者） + SEM 。用單向方差分析同重複測量嚟確定 P 值（ * P < 0.05）。虛線係指檢測嘅檢測極限。 (H) 細胞裂解測定。 FRα-CAR-T 或 GFP-CAR-T 細胞用腺苷（250 μ M ）或 MNA （10 mM ）調整24小時，或未經處理（ Ctrl ）。測量咗 SK-OV-3細胞嘅殺死百分比。用韋爾奇 t 檢驗（ * P < 0.5同 * * P < 0.01）決定 P 值。
為咗獲得對 MNA 依賴性 TNFα 表達調節嘅機制性理解，評估咗 MNA 處理嘅 T 細胞嘅 TNFα mRNA 變化（圖5A ）。用 MNA 處理嘅健康供體 T 細胞嘅 TNFα 轉錄水平增加咗兩倍，表明 MNA 係依賴 TNFα 轉錄調節。為咗研究呢個可能嘅調節機制，我哋評估咗兩種已知嘅調節 TNFα 嘅轉錄因子，即活化 T 細胞核因子（ NFAT ）同特定蛋白1（ Sp1），以反應 MNA 同近端 TNFα 啟動子嘅結合（30）。 TNFα 啟動子包含6個已鑑定嘅 NFAT 結合位點同2個 Sp1結合位點，喺一個位點重疊［5'cap 嘅 -55 個碼對（ bp ）］（30）。染色質免疫沉澱（ ChIP ）顯示，當用 MNA 處理嗰陣， Sp1同 TNFα 啟動子嘅結合增加咗三倍。而納入 NFAT 亦都增加同接近重要性（圖5B ）。呢啲數據表明 MNA 會透過 Sp1轉錄調節 TNFα 嘅表達，同埋喺較少程度上調節 NFAT 嘅表達。
(A) 同冇 MNA 培養嘅 T 細胞相比，用 MNA 處理嘅 T 細胞中 TNFα 表達嘅倍數變化。顯示咗用 SEM 嘅表達模式（ n = 5個健康捐贈者）。代表至少 n = 3個獨立實驗嘅數據。 （ B ）將 NFAT 同 Sp1後，用或冇 8 mM MNA 處理嘅 T 細胞嘅 TNFα 啟動子同（ Ctrl ）同 PMA / 離子霉素刺激組合4個鐘。免疫球蛋白 G （ IgG ）同 H3分別用作免疫沉澱嘅陰性同陽性對照。 ChIP 嘅定量顯示， MNA 處理嘅細胞中 Sp1同 NFAT 同 TNFα 啟動子嘅結合同對照相比增加咗幾倍。代表至少 n = 3個獨立實驗嘅數據。由多個 t 檢驗決定嘅 P 值（*** P < 0.01）。 （ C ）同 HGSC 嘅腹水相比， T 細胞（非細胞毒性）喺腫瘤中顯示出 TNF 嘅表達增加。啲顏色代表唔同嘅病人。顯示嘅儲存格已經隨機抽樣到300個，並且抖動以限制透支（** Padj = 0.0076）。 (D) 卵巢癌嘅 MNA 模型。 MNA 係喺 TME 嘅腫瘤細胞同成纖維體中產生，並且被 T 細胞攝取。 MNA 增加 Sp1同 TNFα 啟動子嘅結合，導致 TNFα 轉錄同 TNFα 細胞因子嘅產生增加。 MNA 亦會引起 IFN-γ 嘅減少。抑制 T 細胞功能會導致殺傷能力下降同加速腫瘤生長。
根據報告， TNF α 有前後依賴嘅抗腫瘤同抗腫瘤作用，但係佢喺促進卵巢癌嘅生長同轉移方面有眾所周知嘅作用（31-33）。根據報告，卵巢癌患者嘅腹水同腫瘤組織中嘅 TNFα 濃度高於良性組織（34-36）。喺機制方面， TNF α 可以調節白細胞嘅活化、功能同增殖，並且改變癌細胞嘅表型（37，38）。同呢啲結果一致，差異基因表達分析顯示，同腹水相比，腫瘤組織嘅 T 細胞中嘅 TNF 顯著上調（圖5C ）。 TNF 表达嘅增加只係喺非細胞毒性表型嘅 T 細胞群體中明顯（圖 S5A ）。總括嚟講，呢啲數據支持咗呢個觀點，即係 MNA 喺 HGSC 中有雙重免疫抑制同促進腫瘤嘅作用。
基於流式細胞術嘅螢光標記已經成為研究 TIL 代謝嘅主要方法。呢啲研究顯示，同外周血淋巴細胞或者嚟自繼發性淋巴器官嘅 T 細胞相比，小鼠同人類嘅 TIL 有較高嘅攝取葡萄糖傾向（4，39），同埋線粒體功能逐漸失去（19，40）。雖然我哋喺呢項研究中觀察到類似嘅結果，但係關鍵嘅發展係比較同一切除腫瘤組織嘅腫瘤細胞同 TIL 嘅代謝。同呢啲之前嘅報告一致，腹水同腫瘤嘅腫瘤（ CD45-EpCAM + ）細胞嘅葡萄糖攝取量高過 CD8 + 同 CD4 + T 細胞，支持腫瘤細胞嘅高葡萄糖攝取量可以同 T 細胞比較。 T 細胞競爭嘅概念。 TME 。但係，腫瘤細胞嘅線粒體活性高過 CD8 + T 細胞，但係線粒體活性同 CD4 + T 細胞相似。呢啲結果加強咗一個新興嘅主題，即係氧化代謝對腫瘤細胞好重要（41，42）。佢哋亦都提出 CD8 + T 細胞可能比 CD4 + T 細胞更容易出現氧化功能障礙，或者 CD4 + T 細胞可能會用葡萄糖以外嘅碳來源去維持線粒體活性（43，44）。應注意嘅係，我哋喺腹水中觀察到 CD4 + T 效因子、 T 效因子記憶同 T 中央記憶細胞之間嘅葡萄糖攝取或線粒體活性冇差異。同樣地，腫瘤中 CD8 + T 細胞嘅分化狀態同葡萄糖攝取嘅變化冇關係，突顯咗體外培養嘅 T 細胞同體內人 TIL 之間嘅顯著差異（22）。呢啲觀察結果亦都透過使用無偏見嘅自動細胞群分配得到證實，進一步顯示出比腫瘤細胞高葡萄糖攝取同線粒體活性嘅 CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + 細胞係普遍存在，但係有代謝活性嘅細胞群。呢個群體可能代表喺 scRNA-seq 分析中鑑定出嚟嘅骨髓抑制細胞或者血漿細胞樹突狀細胞嘅推定亞群體。雖然呢兩種都喺人類卵巢腫瘤中被報告過［45］，但係佢哋仍然需要進一步嘅工作去描述呢個骨髓亞群。
雖然以流式細胞術為基礎嘅方法可以澄清細胞類型之間葡萄糖同氧化代謝嘅一般差異，但係葡萄糖或者其他碳來源用嚟喺 TME 中嘅線粒體代謝所產生嘅精確代謝物仲未確定。將代謝物嘅存在與否分配畀給定嘅 TIL 亞群需要從切除嘅組織中純化細胞群。所以，我哋嘅細胞富集方法結合質譜可以提供對匹配患者樣本中 T 細胞同腫瘤細胞群體中差異富集嘅代謝物嘅見解。雖然呢個方法比起螢光激活細胞分類有優勢，但係某啲代謝物庫可能會因為固有嘅穩定性同/或者快速嘅轉化率而受到影響（22）。不過，我哋嘅方法仍然能夠鑑別出兩種公認嘅免疫抑制代謝物，腺苷同犬尿氨酸，因為佢哋喺樣本類型之間有好大嘅差異。
我哋對腫瘤同 TIL 亞型嘅代謝組學分析可以提供更多對代謝物喺卵巢 TME 中嘅作用嘅見解。首先，我哋用流式細胞術嚟確定腫瘤同 CD4 + T 細胞之間嘅線粒體活性冇差異。然而， LC-MS / MS 分析顯示呢啲人群中代謝物嘅丰度有顯著變化，表明有關 TIL 代謝同佢嘅整體代謝活性嘅結論需要仔細解釋。第二， MNA 係腹水中 CD45細胞同 T 細胞之間差異最大嘅代謝物，而唔係腫瘤。因此，隔間化同腫瘤位置可能對 TIL 代謝有唔同嘅影響，呢個突顯咗特定微環境中可能存在嘅異質性。第三， MNA 生產酶 NNMT 嘅表達主要局限於 CAF ，即係較少程度上嘅腫瘤細胞，但係喺腫瘤衍生嘅 T 細胞中觀察到可檢測嘅 MNA 水平。卵巢 CAF 中 NNMT 嘅過度表達有已知嘅促癌作用，部分係因為促進 CAF 代謝、腫瘤侵襲同轉移（ 27 ）。雖然 TIL 嘅整體水平係中度，但係 CAF 中 NNMT 嘅表達同癌症基因組圖譜（ TCGA ）間質亞型有密切關係，而呢個亞型同預後差有關（27、46、47）。最後，負責 MNA 降解嘅酶 AOX1嘅表達亦都限於 CAF 群體，表明 T 細胞缺乏代謝 MNA 嘅能力。呢啲結果支持呢個觀點，即係雖然需要進一步嘅研究去驗證呢個發現，但係 T 細胞中高水平嘅 MNA 可能表明存在免疫抑制性 CAF 微環境。
鑑於 MNA 輸送體嘅表達水平低，同埋參與 MNA 代謝嘅關鍵蛋白質水平係檢測唔到嘅，所以 T 細胞中 MNA 嘅存在係估唔到嘅。兩個獨立隊伍嘅 scRNA-seq 分析同針對性 qPCR 都檢測唔到 NNMT 同 AOX1。呢啲結果表明 MNA 唔係由 T 細胞合成，而係由周圍嘅 TME 吸收。體外實驗顯示， T 細胞傾向於累積外源性 MNA 。
我哋嘅體外研究顯示，外源性 MNA 會誘導 T 細胞中 TNFα 嘅表達，並且增強 Sp1同 TNFα 啟動子嘅結合。雖然 TNFα 既有抗腫瘤功能，又有抗腫瘤功能，但係喺卵巢癌中， TNF α 可以促進卵巢癌嘅生長（31-33）。卵巢腫瘤細胞培養中嘅 TNFα 嘅中和或者小鼠模型中嘅 TNFα 信號嘅消除可以改善 TNFα 介導嘅炎症細胞因子嘅產生，並抑制腫瘤生長（32，35）。因此，喺呢個情況下， TME 衍生嘅 MNA 可以透過自分泌環嘅 TNFα 依賴機制作為促炎代謝物，從而促進卵巢癌嘅發生同擴散（31）。基於呢個可能性， TNF α 阻斷正被研究為卵巢癌嘅潛在治療劑（37、48、49）。此外， MNA 會損害 CAR-T 細胞對卵巢腫瘤細胞嘅細胞毒性，為 MNA 介導嘅免疫抑制提供進一步證據。總括嚟講，呢啲結果提出咗一個模型，即係腫瘤同 CAF 細胞會分泌 MNA 去細胞外 TME 。透過（ i ） TNF 誘導嘅卵巢癌生長刺激同（ ii ） MNA 誘導嘅 T 細胞細胞毒性活性抑制，呢個可能有雙重嘅腫瘤效果（圖5D ）。
結論係，透過應用快速細胞富集、單細胞測序同代謝分析嘅組合，呢項研究揭示咗 HGSC 患者嘅腫瘤同腹水細胞之間嘅巨大免疫代謝差異。呢個全面嘅分析顯示 T 細胞之間嘅葡萄糖攝取同線粒體活性有差異，並且鑑別出 MNA 係一種非細胞自主免疫調節代謝物。呢啲數據對 TME 點樣影響人類癌症嘅 T 細胞代謝有影響。雖然有報導指出 T 細胞同癌細胞之間會直接競爭營養，但係代謝物亦都可以作為間接調節因子，促進腫瘤進展，同埋可能抑制內源性免疫反應。對呢啲調節代謝物嘅功能作用嘅進一步描述可能會開啟增強抗腫瘤免疫反應嘅替代策略。
患者樣本同臨床數據係透過加拿大組織儲存網絡認證嘅 BC 癌症腫瘤組織儲存庫取得。根據 BC 癌症研究倫理委員會同英屬哥倫比亞大學批准嘅方案（ H07-00463），所有患者嘅樣本同臨床數據都獲得知情書面同意，或者正式放棄佢哋嘅同意。啲樣本會儲存喺經過認證嘅生物銀行（ BRC-00290）。詳細嘅病人特徵如表 S1同 S5所示。對於冷凍保存，手術刀會用嚟機械分解病人嘅腫瘤樣本，然後將佢推過100微米嘅過濾器，以獲得單細胞懸浮液。將患者嘅腹水喺4 °C 下以1500 rpm 離心10分鐘，以顆粒化細胞同除去上清液。由腫瘤同腹水所得嘅細胞喺50 % 熱失活人 AB 血清（ Sigma-Aldrich ）、40 % RPMI-1640（熱費爾科學）同10 % 二甲基亞砜中冷凍保存。將呢啲保存好嘅單細胞懸浮液解凍，然後用嚟做下文所述嘅代謝組學同代謝物測定。
完整培養基由0.22 μ m 過濾嘅50:50補充嘅 RPMI 1640： AimV 組成。 RPMI 1640 + 2.05 mM l- 谷氨酰胺（熱費雪科學）補充 10 % 熱失活人 AB 血清（西格瑪 - 阿爾德里希），12.5 mM 赫佩斯（熱費雪科學），2 mM l- 谷氨酰胺（熱費爾科學） （ PenStrep ）溶液（熱費爾科學）同50 μ MB- 巯基乙醇。 AimV （ Invitrogen ）係用20 mM Hepes （熱費爾科學）同2 mM l- 谷氨酰胺（熱費爾科學）補充。流式細胞儀染色緩衝液由0.22 μ m 過濾磷酸鹽緩衝鹽水（ PBS ； Invitrogen ）組成，並補充3 % 熱失活 AB 人血清（ Sigma ）。細胞富集緩衝液由0.22 μ m 過濾嘅 PBS 組成，並補充0.5 % 熱失活人 AB 血清（ Sigma-Aldrich ）。
喺37 °C 嘅完整培養基中，用10 nM MT DR 同100 μM 2-NBDG 染色細胞30分鐘。接下來，用活性染料 eF506喺4 °C 下染色細胞15分鐘。將細胞重懸浮喺 FC Block （ eBioscience ）同輝煌染色緩衝液（ BD Biosciences ）中，用流式細胞儀染色緩衝液稀釋（按照製造商嘅指示），然後喺室溫下孵育10分鐘。用一組抗體（表 S2）喺流式細胞術染色緩衝液中喺4 °C 下染色20分鐘。喺分析之前，將細胞重懸浮喺流式細胞術染色緩衝液（ Cytek Aurora ；3L-16V-14B-8R 配置）中。用 SpectroFlo 同 FlowJo V10嚟分析細胞計數數據，同埋用 GraphPad Prism 8嚟創建數據。將2-NBDG 同 MT DR 嘅中位數螢光強度（ MFI ）進行對數標準化，然後用配對 t 檢驗進行統計分析，以解釋匹配嘅患者。喺分析入面移除所有事件少於40個嘅群體；喺進行統計分析同數據可視化之前，輸入任何負值嘅 MFI 值1。
為咗補充上述過程面板嘅手動閘控策略，我哋用咗形狀限制樹（ FAUST ）（21）嘅完整註釋，喺 FlowJo 中消除死細胞之後，自動將細胞分配畀群體。我哋手動管理輸出，將似乎分配錯誤嘅群體（將 PD1 + 同 PD1腫瘤細胞結合）同保留嘅群體合併。每個樣本平均含有超過2 % 嘅細胞，總共有11個群體。
菲科爾梯度密度离心法係用嚟將 PBMC 同白細胞分離產品（ STEMCELL 技術）分離。使用 CD8微珠（米爾滕尼）從 PBMC 中分離出 CD8 + T 細胞，並按照製造商嘅指示使用 TransAct （米爾滕尼）喺完整培養基中擴增2星期。將細胞放喺含有 IL-7（10 ng / ml ； PeproTech ）嘅完整培養基中 5 日，然後用 TransAct 重新刺激。喺第7日，根據製造商嘅指示，用人 CD45微珠（ Miltenyi ）連續三輪富集細胞。將細胞等分用於流式細胞測定分析（如上所述），並將100萬個細胞等分三次進行 LC-MS / MS 分析。啲樣本係用 LC-MS/MS 處理，如下所述。我哋用1，000個離子數估計咗缺少嘅代謝物值。每個樣本都係用總離子數（ TIC ）標準化，對數轉換，然後喺分析之前喺 MetaboAnalystR 自動標準化。
將每位患者嘅單細胞懸濁液解凍，並經由 40 μm 過濾器過濾成完整培養基 ( 如上所述 ) 。根據製造商嘅方案，用 MicroBeads （ Miltenyi ）嘅磁珠分離方法連續三輪陽性選擇，用嚟富集樣本嘅 CD8 + 、 CD4 + 同 CD45- 細胞（喺冰上）。總之，將細胞重懸浮喺細胞富集緩衝液入面（如上所述），然後計數。將細胞用人 CD8珠、人 CD4珠或者人 CD45珠（ Miltenyi ）喺4 °C 下溫育15分鐘，然後用細胞富集緩衝液洗淨。將樣本經過 LS 柱（ Miltenyi ），然後收集正同負嘅分數。為咗縮短持續時間同埋最大化細胞恢復步驟，之後用 CD8組分嚟做第二輪 CD4 + 富集，而 CD4組分就用嚟做隨後嘅 CD45富集。喺整個分離過程中，將溶液保持喺冰上。
為咗準備代謝物分析嘅樣本，細胞用冰冷嘅鹽溶液洗淨一次，每個樣本加入1 ml 80 % 甲醇，然後喺液氮中漩渦同快速凍結。將樣本經過三次凍解凍循環，並喺4 °C 下以14,000 rpm 離心15分鐘。將含有代謝物嘅上清液蒸發直至乾燥。將代謝物重新溶解喺50 μl 0.03 % 甲酸中，漩渦混合，然後離心去除碎片。
如上所述提取代謝物。將上清液轉移到高效液相色譜瓶中進行代謝組學研究。使用隨機處理方案，用相似數量嘅細胞處理每個樣本，以防止批次效應。我哋對之前喺 AB SCIEX QTRAP 5500三重四極質譜計上發表過嘅全球代謝物進行咗定性評估（50）。色譜分析同峰面積積分係用 MultiQuant 2.1版軟件（應用生物系統 SCIEX ）進行。
1000個離子數用嚟估計缺失嘅代謝物值，而每個樣本嘅 TIC 用嚟計算每個檢測到嘅代謝物嘅標準化峰面積，以校正儀器分析喺樣本處理中引入嘅變化。 TIC 標準化後， MetaboAnalystR （51）（預設參數）用於對數轉換同自動規範線縮放。我哋用咗 PCA 同素食 R 包去進行樣本類型之間代謝組差異嘅探索性分析，同埋用部分冗餘分析去分析病人。用 Ward 方法構建熱圖樹狀圖，嚟將樣本之間嘅歐幾里得距離聚類。我哋用咗標準化代謝物丰度嘅 limma （52）嚟識別整個細胞類型同微環境嘅差異丰度代謝物。為咗簡化解釋，我哋用群體平均值參數去指定模型，並將微環境中嘅細胞類型視為每個群體（ n = 6個群體）；對於顯著性測試，我哋對每種代謝物進行咗三次重複測量為咗避免假複製，將病人納入咗 limma 設計嘅障礙。為咗檢查唔同患者之間嘅代謝物差異，我哋以固定方式調整咗包括患者嘅 limma 模型。我哋報告咗預先指定嘅細胞類型同 Padj <0.05嘅微環境對比之間嘅顯著性（本雅米尼 - 霍赫伯格校正）。
使用 Miltenyi 死細胞去除試劑盒（ > 80 % 活性）進行活力富集後，使用10x 5'基因表達方案對總活凍結腹水同腫瘤樣本進行單細胞轉錄組測序。分析咗五個有匹配腫瘤同腹水嘅病例，雖然有一個腫瘤樣本嘅低生存能力阻止咗佢嘅納入。為咗達到多重選擇患者，我哋將10x鈦控制器嘅通道中每個患者嘅樣本結合埋一齊，並分別分析腹水同腫瘤部位。測序後［ Illumina HiSeq 400028 × 98 bp 配對末端（ PE ），魁北克基因組；平均每個細胞分別有73，488個同41，378個讀取值，分別係腫瘤同腹水］］，我哋用咗 CellSNP 同 Vireo （53）（基於 CellSNP 作為由 GRCh38提供嘅常見人類 SNP （ VCF ）分配咗捐贈者身份。我哋用 SNPRelate 嚟推斷最接近嘅同一性（ IBS ）作為患者嘅未識別細胞同未識別細胞（包括 IBS 基因）腹水同腫瘤樣本之間嘅雙層同匹配捐贈者（54）喺呢個任務嘅基礎上，我哋保留咗三個喺腫瘤同腹水中有大量細胞代表嘅個案，用嚟進行下游分析（57）根據 Jaccard 嘅距離，根據標記基因表達，將聚類手動註解到推定嘅細胞類型，並用 t-SNE 嚟可視化細胞毒性 T 細胞，唔包括佢哋嘅低核糖體蛋白表達嘅亞聚類（ SNN ） t-SNE 嵌入，可以控制免疫細胞標記同 NNMT 表達之間嘅表達重疊。
用菲科爾梯度密度离心法將 PBMC 同白細胞分離產品（ STEMCELL 技術）分離。 CD3 + 細胞係用 CD3珠（米爾滕尼）喺 PBMC 中分離出嚟。喺有或冇 MNA 嘅情況下， CD3 + 細胞會用板結合嘅 CD3（5 μ g / ml ）、可溶性 CD28（3 μ g / ml ）同 IL-2（300 U / ml ；白細胞原蛋白）激活。喺擴張嘅最後一日，用流式細胞術評估咗生存能力（固定生存染料 eFluor450， eBioscience ）同增殖（123計數 eBeads ，熱費爾科學）。評估效因子功能，用 PMA （20 ng/ml ）同離子霉素（1 μ g / ml ）同 GolgiStop 刺激細胞4個鐘，並監測 CD8-PerCP （ RPA-T8，生物傳奇）、 CD4-AF700（ RPA-T4）、生物傳奇）同 TNFα- 氟18 BD ）。用 PMA （20 ng / ml ）同離子黴素（ 1 μ g / ml ）刺激 qPCR 同 ChIP 細胞4個鐘。喺用 PMA （20 ng/ml ）同離子霉素（1 μg/ml）刺激4個鐘之前同之後收集 ELISA 上清液。
按照製造商嘅方案，用 RNeasy Plus 迷你試劑盒（ QIAGEN ）分離 RNA 。用 QIA 碎片機（ QIAGEN ）將樣本均質化。用大容量 RNA 轉 cDNA 試劑盒（熱費爾科學）合成互補 DNA （ cDNA ）。使用 TaqMan 快速先進母混合（熱費爾科學）用以下探針量化基因表達（根據製造商嘅方案）： Hs00196287 _ m1（ NNMT ）、 Hs00154079 _ m1（ AOX1）、 Hs00427552 _ m1（ SLC1427 [ 甘油醛 -3- 磷酸離氫（ GAPDH ）］同 Hs01010726 _ m1（ SLC22A2）。樣本係喺 StepOnePlus 實時 PCR 系統（應用生物系統）（應用生物系統）上，喺 MicroAmp 快速光學96孔反應板（應用生物系統）同 MicroAmp 光學膜上運行。任何超過35嘅 Ct 值都會被視為高於檢測閾值，並標記為檢測唔到。
按照之前所講嘅方法進行 ChIP （58）。總之，將細胞用甲醛處理（最終濃度1.42 % ），然後喺室溫下溫育10分鐘。喺冰上使用補充嘅膨脹緩衝液（25 mM Hepes 、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl 同0.1 % NP-40）10分鐘，然後按照所述重懸浮喺免疫沉澱緩衝液中（58）。然後用以下嘅循環對樣本進行超聲波處理：10個循環（20個1秒脈衝）同40秒嘅靜態時間。將 ChIP 級免疫球蛋白 G （細胞信號技術；1 μ l ）、組蛋白 H3（細胞信號技術；3 μ l ）、 NFAT （ Invitrogen ；3 μ l ）同 SP1（細胞信號技術；3 μ l ）抗體同樣本喺4 °CC 下搖晃過夜。將蛋白 A 珠（ Thermo Fisher 科學）同樣本喺4 ° C 下，輕輕搖晃1個鐘，然後用 chelex 珠（ Bio-Rad ）富集 DNA ，同埋用蛋白酶 K （ Thermo Fisher ）進行蛋白質消化。用 PCR 檢測 TNF α 啟動子：正向， GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT ；相反， GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG （207 bp 產物）。圖像係由圖像實驗室（ Bio-Rad ）製作，並使用 ImageJ 軟件進行量化。
如上所述收集細胞培養上清液。測定係根據人 TNFα ELISA 試劑盒（ Invitrogen ）、人 IL-2 ELISA 試劑盒（ Invitrogen ）同人 IFN-γ ELISA 試劑盒（ Abcam ）嘅製造商程序進行。根據製造商嘅方案，將上清液稀釋1:100嚟檢測 TNF α 同 IL-2，同埋1:3稀釋嚟檢測 IFN- γ 。使用 EnVision 2104多標籤讀取器（珀金埃爾默）喺450納米嘅吸光度測量。
用菲科爾梯度密度离心法將 PBMC 同白細胞分離產品（ STEMCELL 技術）分離。 CD3 + 細胞係用 CD3珠（米爾滕尼）喺 PBMC 中分離出嚟。喺有或冇 MNA 嘅情況下，用板結合嘅 CD3（5 μ g / ml ）、可溶性 CD28（3 μ g / ml ）同 IL-2（300 U / ml ；白細胞原蛋白）活化 CD3 + 細胞3日。天後，收集細胞並用0.9 % 生理鹽水洗淨，並將顆粒快速凍結。細胞計數係用123計數電子珠嘅流式細胞術（細胞極光；3L-16V-14B-8R配置）進行。
如上所述提取代謝物。將乾燥嘅提取物以4000細胞當量/μl嘅濃度重建。用反相色譜（1290 Infinity II ，安捷倫科技，聖塔克拉拉，加利福尼亞州）同 CORTECS T3柱（2.1 × 150毫米，粒徑1.6 μ m ，孔徑120 - Å ； # 186008500，沃特斯）分析樣本。極性質譜計（6470，安捷倫），其中電噴電離係以正模式運作。流動相 A 係0.1 % 甲酸（喺 H2O 中），流動相 B 係90 % 乙腈，0.1 % 甲酸。 100 % A 嘅 LC 梯度係0至2分鐘，99 % B 嘅 2 至7.1分鐘，99 % B 嘅7.1至8分鐘，然後用流動相 A 以0.6毫升/分鐘嘅流速重新平衡柱3分鐘。 。流速為0.4ml / min ，柱室加熱至50 ° C 。用 MNA 嘅純化學標準（ M320995，多倫多研究化學公司，加拿大安大略省北約克）嚟確定保留時間（ RT ）同轉化（ RT = 0.882分鐘，轉化1 = 137 → 94.1，轉化 2 = 137 → 92，轉化 3 = 137 → 78）。當三個轉換都喺正確嘅保留時間發生嗰陣，轉換1就會用嚟量化，以確保特異性。 MNA （多倫多研究化學公司）嘅標準曲線係由六次連續稀釋嘅原液（1 mg/ml）產生，得到分別係0.1、1.0、10同100 ng/ml同1.0同10μg/ml嘅標準液體。檢測極限為 1 ng / ml ，線性響應介乎 10 ng / ml 至 10 μ g / ml 之間。每次注入兩微升嘅樣本同標準品，用嚟進行 LC/MS 分析，而每八次注入就會運行一個混合質量控制樣本，以確保分析平台嘅穩定性。所有 MNA 處理過嘅細胞樣本嘅 MNA 反應都喺測定嘅線性範圍之內。數據分析係用 MassHunter 定量分析軟件（ v9.0，安捷倫）進行。
第二代 αFR-CAR 構建體係取自宋等人。 （59）。總之，構建體包含以下內容： CD8a 前導序列、人 αFR 特異性單鏈可變片段、 CD8a 鍊條同跨膜區域、 CD27細胞內結構域同 CD3z 細胞內結構域。完整嘅 CAR 序列係由 GenScript 合成，然後克隆到用嚟評估轉導效率嘅 GFP 表達盒上游嘅第二代慢病毒表達載體。
慢病毒係由 HEK293T 細胞轉染而產生［美國型培養收藏（ ATCC ）；喺含有10 % 胎牛血清（ FBS ）同1 % PenStrep 嘅杜爾貝科改良鷹培養基中生長，並使用 CAR-GFP 輸送體同包裝質粒（ psPAX2同 pMD2. G ， Addgene ）使用脂肪轉染胺（ Sigma-Aldrich ）。喺轉染後48同72小時收集含病毒嘅上清液，過濾，然後用超聲波离心濃縮。將濃縮嘅病毒上清液儲存喺 -80 ° C 直至轉導。
透過菲科爾梯度密度离心法，將 PBMC 同健康捐贈者白細胞分離產品（ STEMCELL 技術）分離。用陽性選擇 CD8微珠（ Miltenyi ）喺 PBMC 中分離 CD8 + 細胞。用 TransAct （米爾滕尼）同埋喺 TexMACS 培養基中刺激 T 細胞［米爾滕尼；補充咗3 % 熱滅活人血清，1 % PenStrep 同 IL-2（300 U / ml ）］。刺激後24小時，用慢病毒（每106個細胞10 μ l 濃縮病毒上清液）轉導 T 細胞。喺 Cytek Aurora 轉導後1至3日（喺 FSC （前向散射）/ SSC （側向散射）、單體、 GFP + ）上，評估細胞嘅 GFP 表達，以證明轉導效率至少係30 % 。
喺以下條件下，將 CAR-T 細胞喺免疫培養（ STEMCELL 技術；補充1 % PenStrep ）中培養24小時：未經處理，用250 μM 腺苷或10 mM MNA 處理。預處理後，用 PBS 洗淨 CAR-T 細胞，並同20，000個 SK-OV-3細胞結合［ATCC ；喺麥可 5A 培養基（ Sigma-Aldrich ）中，補充咗10 % FBS 同1 % PenStrep ，喺10時：效因子同靶嘅比例係1，喺補充嘅免疫培養基中三份擴增。 SK-OV-3細胞同用洋地黃皂苷（0.5mg / ml ；西格瑪 - 阿爾德里希）溶解嘅 SK-OV-3細胞分別用作陰性同陽性對照。共培養24小時後，收集上清液，並按照製造商嘅指示（LDH Glo 細胞毒性測定試劑盒， Promega ）測量乳酸脫氫酶（ LDH ）。將 LDH 上清液喺 LDH 緩衝液中稀釋1:50。殺死百分比係用以下公式測量：殺死百分比 = 矯正百分比 / 最大殺死率 x 100 % ，其中矯正百分比 = 只係共培養 T 細胞，而最大殺死率 = 陽性對照 - 陰性對照。
如文字或材料和方法所述，使用 GraphPad Prism 8、微軟 Excel 或 R v3.6.0進行統計分析。如果係喺同一個病人身上收集多個樣本（例如腹水同腫瘤），我哋會用配對 t 檢驗，或者將病人作為隨機效應納入線性或廣泛模型，視乎情況而定。對於代謝組學分析，重要性測試係一式三份進行。
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瑪麗莎 · 基爾高（瑪麗莎 · 基爾高）、莎拉 · 麥克弗森（莎拉 · 麥克弗森）、勞倫 · 扎卡里亞斯（勞倫 · 扎卡里亞斯）、阿比蓋爾 · 埃利 · 阿里斯 · 沃森（ H . 沃森）、約翰 · 斯塔格（約翰 · 斯塔格）、布拉德 · 納爾遜（布拉德 · 納爾遜）、拉素G. 瓊斯（羅素 G. 瓊斯）、菲尼亞斯 T. 漢密爾頓（菲尼亞斯 T .
MNA 有助於 T 細胞嘅免疫抑制，亦代表咗一個潛在嘅免疫療法靶點，用嚟治療人類癌症。
瑪麗莎 · 基爾高（瑪麗莎 · 基爾高）、莎拉 · 麥克弗森（莎拉 · 麥克弗森）、勞倫 · 扎卡里亞斯（勞倫 · 扎卡里亞斯）、阿比蓋爾 · 埃利 · 阿里斯 · 沃森（ H . 沃森）、約翰 · 斯塔格（約翰 · 斯塔格）、布拉德 · 納爾遜（布拉德 · 納爾遜）、拉素G. 瓊斯（羅素 G. 瓊斯）、菲尼亞斯 T. 漢密爾頓（菲尼亞斯 T .
MNA 有助於 T 細胞嘅免疫抑制，亦代表咗一個潛在嘅免疫療法靶點，用嚟治療人類癌症。
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